ABSTRAK
Meskipun strategi pengobatan saat ini telah meningkatkan hasil klinis untuk kanker lambung, strategi tersebut menghadirkan prognosis yang menantang yang memerlukan pendekatan terapi baru. Reseptor 5-HT7, anggota keluarga reseptor serotonin, memainkan peran penting dalam memengaruhi patogenesis berbagai jenis kanker. Studi ini berupaya menyelidiki interaksi kompleks antara reseptor 5-HT7, kanker lambung, dan proses apoptosis. Serangkaian teknik eksperimental yang komprehensif digunakan, termasuk uji pewarnaan in vitro untuk penilaian apoptosis, PCR waktu nyata, dan uji proliferasi sel. Temuan menunjukkan bahwa agonis reseptor 5-HT7 meningkatkan proliferasi sel kanker jaringan lambung primer dan sel KATO-III, sedangkan pengobatan dengan antagonis reseptor 5-HT7 secara signifikan menghambat proliferasi sel. Analisis ekspresi mRNA reseptor 5-HT7 pada populasi pasien kanker lambung menunjukkan kadar yang meningkat secara signifikan pada jaringan kanker jika dibandingkan dengan yang ada di jaringan sehat. Pemberian agonis reseptor 5-HT7 (LP44) mengakibatkan peningkatan proliferasi sel pada sel kanker lambung primer dan lini sel KATO-III, sedangkan pengobatan dengan antagonis reseptor 5-HT7 (SB-269970) secara signifikan menghambat proliferasi. Selain itu, sel KATO-III yang diobati dengan antagonis reseptor 5-HT7 menunjukkan peningkatan regulasi yang nyata pada tingkat mRNA gen caspase-3, caspase-9, dan BAX. Sebaliknya, pengobatan dengan antagonis reseptor 5-HT7 dikaitkan dengan penurunan yang signifikan dalam ekspresi faktor nuklir kappa B dan tingkat mRNA reseptor 5-HT7. Pewarnaan Annexin V-FITC/PI dan Hoechst 33342 menunjukkan efek apoptosis yang nyata melalui antagonisme reseptor 5-HT7 dibandingkan dengan kelompok lain. Secara kolektif, temuan penelitian ini menunjukkan bahwa peningkatan ekspresi reseptor 5-HT7 memengaruhi pembentukan kanker lambung dengan mengatur sumbu apoptosis. Hal ini memberikan perspektif baru untuk memahami mekanisme molekuler yang mendasari potensi reseptor 5-HT7 sebagai pendekatan yang ditargetkan untuk memerangi kanker lambung melalui jalur apoptosis.

1 Pendahuluan
Kanker lambung (GC) merupakan tantangan kesehatan global yang berat, dan salah satu penyebab utama kematian akibat kanker di seluruh dunia [ 1 ]. GC juga merupakan beban kanker tertinggi ketika dinilai berdasarkan disabilitas bagi pasien dan industri perawatan kesehatan. Sekitar 90% GC adalah adenokarsinoma [ 2 ]. Hasil klinis untuk pasien dengan GC stadium lanjut umumnya buruk, meskipun ada kemajuan dalam diagnosis, pengembangan protokol kemoterapi baru, dan kemajuan signifikan dalam teknik pembedahan, dengan kelangsungan hidup 5 tahun sebesar 5%–20% [ 3 ].

Secara tradisional dikenal sebagai neurotransmitter dalam sistem saraf pusat, serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) baru-baru ini mengungkap berbagai efeknya pada proses seluler, termasuk proliferasi, apoptosis, dan inflamasi, dalam jaringan perifer. Terutama, 5-HT telah dikaitkan dengan fungsi SSP. Namun, kontribusinya terhadap penyakit perifer seperti inflamasi [ 4 ], kanker prostat [ 5 ], cedera paru-paru [ 6 ], sindrom dumping [ 7 ], dan kolitis [ 8 ] juga telah ditunjukkan. Selain sifat-sifat 5-HT, ia merupakan faktor mitogenik karena berbagai alasan. Karena 5-HT berfungsi sebagai agen mitogenik dalam berbagai sel normal dan tumor, reseptor 5-HT juga dapat terlibat dalam patofisiologi berbagai kanker [ 9 – 11 ]. Pengungkapan ini telah memicu lonjakan minat untuk memahami interaksi rumit antara serotonin dan reseptornya, khususnya reseptor 5-HT7, dalam konteks biologi kanker.

Reseptor 5-HT7, anggota utama dari keluarga reseptor serotonin, dikaitkan dengan banyak keadaan penyakit dan gangguan pada sistem saraf pusat dan perifer [ 12 , 13 ]. Khususnya, ekspresi reseptor 5-HT7 telah dideteksi dalam berbagai jaringan kanker, yang menunjukkan potensi keterlibatannya dalam patogenesis tipe kanker tertentu [ 14 – 18 ]. Secara khusus, penyelidikan telah menyoroti sifat mitogenik serotonin, yang memicu proliferasi sel tumor pada kanker prostat, pankreas, paru-paru, dan usus besar. Bersamaan dengan itu, yang menarik, antagonis reseptor 5-HT7 telah menunjukkan efek penghambatan pada sel tumor ini, yang menghadirkan reseptor 5-HT7 sebagai target potensial untuk intervensi terapi baru. Reseptor serotonin ektopik 5-HT7 dievaluasi dalam karsinoma adrenokortikal, dan efek serotonin pada aktivitas sekresi tumor adrenokortikal ganas telah dibuktikan [ 19 ]. Adanya reseptor 5-HT7 yang berfungsi dalam lini sel glioblastoma manusia menunjukkan potensi keterlibatan reseptor ini dalam inisiasi dan perkembangan kanker [ 5 , 20 ]. Karena serotonin telah dikenal sebagai penanda tumor karsinoid gastrointestinal, serta, sampai batas tertentu, karsinoid bronkial, hati, dan ovarium, ada kemungkinan bahwa reseptor 5-HT7 memainkan peran penting dalam patologi berbagai jenis GC [ 15 , 21 ].

Artikel ini meneliti potensi reseptor 5-HT7 sebagai pendekatan terarah untuk mengatasi GC melalui jalur apoptosis. Dengan meneliti interaksi rumit antara reseptor 5-HT7, GC, dan proses apoptosis, kami bertujuan untuk mengidentifikasi kemungkinan jalan untuk pengembangan strategi terapi tingkat lanjut dalam memerangi penyakit yang mematikan ini.

2 Metode
2.1 Persetujuan Etis
Semua tahapan investigasi dinyatakan mematuhi standar etika oleh Universitas Ataturk (Erzurum/Türkiye), Fakultas Kedokteran, Komite Etik Penelitian Klinik Noninvasif (20.03.2014; 4/11).

Penelitian ini melibatkan 12 pria/wanita berusia 18 hingga 75 tahun yang menderita GC derajat III atau IV (parameter klinis umum yang diperkirakan melalui sistem stadium kanker).

Kriteria untuk dimasukkan dalam penelitian adalah sebagai berikut: Pasien harus memiliki diagnosis yang dikonfirmasi secara histologis dari adenokarsinoma lambung stadium lanjut (Stadium III/IV) dan tidak boleh menjalani kemoterapi, imunoterapi, atau terapi target 1 bulan sebelum penelitian.

2.2 Pemurnian Total RNA dari Potongan Jaringan FFPE
Blok parafin dari 12 pasien pria/wanita yang menerima diagnosis GC antara tahun 2014 dan 2015 di Rumah Sakit Universitas Ataturk, Departemen Patologi (Erzurum/Türkiye), diteliti. Empat atau lima bagian sepanjang 5 m dari setiap blok pengawetan diiris segar untuk mengambil RNA dari jaringan FFPE. Hanya tumor atau jaringan stroma peritumoral yang disertakan setelah setiap segmen dibedah menggunakan pisau. Parafin dihilangkan dengan menggunakan ekstraksi xilena, diikuti dengan pencucian etanol. Mengikuti petunjuk pabrik, RNA diperoleh menggunakan kit All Prep RNA FFPE dari Qiagen di Hille, Jerman. Konsentrasi total RNA diperiksa dengan bantuan Sistem Spektrofotometer Epoch dan Pelat Take 3.

2.3 Sampel Segar
12 sampel jaringan GC beku segar dan sampel jaringan mukosa lambung normal yang sebanding (lebih dari 10 cm dari tepi GC) diambil dari individu dengan GC dalam waktu 30 menit setelah reseksi. Sampel-sampel ini kemudian dibekukan dalam nitrogen cair dan disimpan pada suhu 80°C hingga digunakan. Jaringan GC diambil dari arsip Departemen Bedah Umum di Rumah Sakit Universitas Ataturk antara Januari 2015 dan Desember 2016. Dua ahli patologi terkemuka dari Departemen Patologi rumah sakit melakukan evaluasi histologis semua sampel jaringan. Sebelum prosedur pembedahan, persetujuan yang diberikan diperoleh dari setiap pasien.

2.4 Kultur Sel Primer
Semua fase investigasi ditemukan mematuhi standar etika oleh Komite Etik Nasional – Pusat Penelitian dan Aplikasi Eksperimental Medis Universitas Ataturk (05.05.2017; 2/03). Fragmen adenokarsinoma lambung yang diperoleh melalui pembedahan dengan cepat dipindahkan ke laboratorium kultur sel dalam medium eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM 4,5 g/dL glukosa) yang mengandung 10% antibiotik fetal bovine serum (FBS). Fragmen tumor adenokarsinoma dipotong menjadi potongan-potongan kecil menggunakan gunting steril. Setelah dipisahkan secara hati-hati dengan sentrifugasi dan pencucian dengan phosphate-buffered saline (PBS), sel tumor dikultur dalam labu kultur steril berukuran 25 cm 2 yang berisi DMEM pada suhu 37°C dalam atmosfer humidifikasi 5% CO 2 . Kultur subkonfluen dipisahkan dengan Tripsin-EDTA dan dihitung dengan metode penghitungan trypan blue (Sigma-Aldrich, AS). Tripsinisasi digunakan untuk mengisolasi sel tumor ketika terjadi peningkatan jumlah sel tumor yang nyata. Mikroskop terbalik digunakan untuk mengamati kultur sel selama sekitar 12–72 jam.

Untuk menentukan nilai IC 50 untuk LP44 dan SB-269970, 5000 sel/well disemai dalam medium standar; setelah 24 jam, sel-sel tersebut diobati dengan 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 µM LP44, dan SB-269970 dalam pelat 96-well dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi, larutan MTT (5 mg/mL) ditambahkan dan diinkubasi selama 4 jam. Setelah inkubasi yang diperlukan, sel-sel tersebut dilarutkan dalam DMSO untuk melarutkan formazan, produk konversi MTT. Absorbansi densitas optik sel diukur pada 570 nm. Obat-obatan diselidiki untuk aktivitasnya sebagai agen tunggal. Penghambatan pertumbuhan dinyatakan sebagai % kontrol (media saja dan tanpa obat) dan dikuantifikasi oleh nilai IC 50. Semua percobaan dilakukan secara independen setidaknya tiga kali [ 5 ].

LP44 adalah agonis reseptor serotonin 5-HT7 (Nomor Cas: 824958-12-5, Sigma-Aldrich). SB-269970 adalah antagonis reseptor serotonin 5-HT7 (Nomor Cas: 261901-57-9, Sigma-Aldrich).

2.5 Kultur Sel KATO-III
Lini sel KATO-III (Human, Stomach, Gastric Carcinoma) American Type Culture Collection (ATCC, AS) disediakan. Lini sel dalam Cryotube dalam nitrogen cair dikeluarkan dari tangki dan dibiarkan larut dalam penangas air pada suhu 37°C selama beberapa saat. Sel yang dapat larut dipindahkan ke labu dengan T75 cm 2 . Setelah 48 jam, sel KATO-III dihitung pada 2 × 10 5 sel/sumur dalam DMEM yang mengandung 10% FBS dan, disemai dalam pelat 96-sumur dan diinkubasi pada suhu 37°C dalam atmosfer lembap yang mengandung 5% CO 2 .

2.6 Pemantauan Pertumbuhan dan Proliferasi Sel Secara Real-Time
Sistem xCelligence, metode bebas label untuk pemantauan dinamis sel hidup, digunakan untuk mengevaluasi pertumbuhan sel GC primer dan sel KATO-III. Semua zat diencerkan secara serial, dan sel-sel diberikan konsentrasi DMSO akhir sebesar 0,1%. Sel kontrol juga diberikan DMSO 0,1%. Pertama, media DMEM digunakan untuk menyemai 5000 sel GC primer atau sel KATO-III ke dalam setiap sumur. Setelah 24 jam, sel-sel tersebut diobati dengan 10 -6  M LP44 dan SB-269970. Pelat dengan elektroda emas digunakan dalam sistem xCELLigence. Indeks sel, interaksi sel dan elektroda, mencerminkan jumlah sel, adhesi, dan pertumbuhan dan diukur sebagai respons impedansi. Selama percobaan, pengukuran otomatis dilakukan setiap 15 menit. Data dapat diakses sebagai indeks sel yang dinormalisasi.

2.7 PCR Waktu Nyata
Prosedur untuk ekstraksi total RNA dan sintesis cDNA mengikuti prosedur yang dijelaskan secara rinci dalam penelitian kami sebelumnya [ 22 ]. MRNA diekstraksi dari sel KATO-III yang dihomogenkan. Mengikuti rekomendasi pabrik, total mRNA dimurnikan menggunakan peralatan QIACUBE. High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit digunakan untuk mentranskripsi balik sampel RNA menjadi cDNA [10]. Kami menggunakan spektrofotometer untuk menentukan kemurnian dan kuantitas mRNA dan cDNA yang kami peroleh.

2.8 Kuantifikasi Relatif Ekspresi Gen
Analisis ekspresi mRNA 5-HTR7, NF-kB, CAS-3, CAS-9, dan BAX relatif dilakukan dengan sistem reaksi berantai polimerase (PCR) StepOne Plus secara real-time menggunakan cDNA yang disintesis dari sel KATO-III dan sampel blok parafin tingkat ekspresi mRNA 5-HTR7 serta RNA sampel lambung segar. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1 , primer yang dirancang untuk manusia digunakan dalam PCR real-time.

TABEL 1. Urutan primer yang digunakan dalam PCR waktu nyata.

Hasilnya dibandingkan dengan kelompok kontrol dan ditampilkan sebagai lipatan relatif. Kontrol endogen (ß-aktin) digunakan sebagai data ekspresi untuk setiap kelompok sel. Dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya, penelitian ini dilakukan sesuai prosedur standar dan sesuai dengan petunjuk pabrik [ 23 ]. Semua hasil dilaporkan sebagai perubahan lipatan dalam ekspresi dibandingkan dengan kelompok sel menggunakan teknik 2 -ΔΔ Ct [ 24 ].

2.9 Uji Pewarnaan Hoechst 33342
Pewarnaan Hoechst 33342 digunakan untuk mengidentifikasi kematian sel apoptosis. Penelitian dilakukan sesuai dengan pedoman yang diberikan oleh produsen dan penelitian kami sebelumnya. Modifikasi dilacak menggunakan mikroskop terbalik LEICA [ 5 ].

2.10 Uji Pewarnaan Ganda Annexin V-FITC/PI
Sel KATO-III (2,5 × 10 5 /well) disemai dalam pelat 6-well, dan agonis/antagonis reseptor 5-HT7 diaplikasikan selama 24 jam. Sel diperoleh menggunakan kit deteksi AnnexinV-FITC sesuai dengan petunjuk pabrik. CytoFLEX mengidentifikasi fluoresensi merah dari PI dan fluoresensi hijau dari Annexin V-FITC. Perangkat Lunak CytExpert menggunakan data untuk menganalisis [ 5 ].

2.11 Analisis Statistik
Studi kultur sel dilakukan tiga kali, dan data diberikan sebagai mean ± simpangan baku (SD). Uji Shapiro-Wilk digunakan untuk memastikan kepatuhan dengan distribusi normal (Gaussian) untuk setiap kelompok. Nilai-p yang melebihi 0,05 dianggap menunjukkan distribusi normal. Lebih jauh, uji Skewness dan Kurtosis digunakan untuk memastikan kenormalan distribusi, sementara uji Levene digunakan untuk menilai homogenitas varians. ANOVA digunakan untuk menganalisis varians untuk menemukan perbedaan signifikan antara kelompok. Posttest Tukey digunakan untuk beberapa perbandingan. Statistik dianggap signifikan untuk nilai-p kurang dari 0,05. Ketika distribusi normalitas data ditolak, perbandingan antara kedua kelompok dilakukan dengan menggunakan uji Mann-Whitney U. Uji Whitney U digunakan untuk menentukan apakah ada perbedaan reseptor 5-HT7 antara jaringan normal dan ganas. Pengujian serupa dilakukan pada Windows menggunakan GraphPad Prism 6.0.

3 Hasil
3.1 Peningkatan Reseptor 5-HT7 di Jaringan GC
Studi kami pertama kali mengamati tingkat ekspresi reseptor 5-HT7 dari jaringan FFPE GC dan membandingkannya dengan jaringan FFPE yang sehat. File pasien juga ditinjau pada tahap ini, dan data PCR waktu nyata dibandingkan. Semua pasien memiliki adenokarsinoma; beberapa tumor adalah T4N2, dan yang lainnya adalah T4N3. Dalam analisis jaringan FFPE kami, ekspresi mRNA reseptor 5-HT7 yang terdeteksi dalam jaringan kanker meningkat secara signifikan dibandingkan dengan jaringan sehat. Di sini, pentingnya reseptor 5-HT7 dalam jaringan GC terlihat (Gambar 1A ). Perbandingan yang sama dilakukan pada jaringan segar yang diambil dari operasi untuk memvalidasi hasil. Di sini, tingkat ekspresi mRNA 5-HT7 dalam GC meningkat secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol ( p  < 0,001) (Gambar 1B ).

GAMBAR 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Perbandingan ekspresi mRNA reseptor 5-HT7 yang diperoleh dari jaringan GC FFPE dengan jaringan sehat (A). Ekspresi reseptor mRNA 5-HT7 pada jaringan segar sehat dan kanker dari pasien GC (B). Hasilnya dievaluasi menurut uji Mann-Whitney U. *** p  < 0,001 signifikan.
3.2 Mengurangi Proliferasi Sel GC melalui Antagonis Reseptor 5-HT7
IC50 untuk LP44 dan SB-269970 ditentukan dalam lini sel yang diuji. Untuk lini sel GC primer, nilai IC50 agonis dan antagonis masing -masing adalah 1,09 dan 8,84 µM. LP44 menstimulasi dan SB269970 menghambat proliferasi sel secara signifikan pada konsentrasi 10 -6  M ( Gambar 2A, B ).

GAMBAR 2
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Pengaruh dosis yang berbeda dari agonis reseptor 5-HT7 (LP44) dan antagonis (SB-269970) terhadap proliferasi sel yang bergantung pada dosis dalam garis sel GC dalam 72 jam. (A) agonis (LP44). (B) antagonis (SB-269970). * p  < 0,05, ** p  < 0,01, dan *** p  < 0,001 menunjukkan tingkat signifikansi dibandingkan dengan kelompok kontrol.
Berdasarkan hasil ini, kami melakukan uji viabilitas bergantung waktu dengan dosis LP44 dan SB-269970 yang kami terapkan pada sel GC melalui xCELLigence. Pemberian antagonis reseptor 5-HT7 secara signifikan menghambat sel GC dalam cara bergantung waktu (Gambar 3A–D ).

GAMBAR 3
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Efek dosis 10⁻⁶ M agonis reseptor 5-HT7 (LP44) dan antagonis (SB-269970) pada proliferasi sel bergantung waktu dalam garis sel GC pada 24 (A), 48 (B), dan 72 (C) jam, bersama dengan kelompok kontrol dan indeks sel bergantung waktu (D). Hasilnya dievaluasi menurut uji Tukey. * p  < 0,05, ** p  < 0,01, *** p  < 0,001 menunjukkan tingkat signifikansi dibandingkan dengan kelompok kontrol.
Demikian pula, aplikasi kami dibuat untuk lini sel KATO-III. Efek agonis dan antagonis reseptor 5-HT7 pada proliferasi diikuti oleh xCELLigence. Sekali lagi, pemberian agonis reseptor 5-HT7 tidak mengubah proliferasi sel pada jam ke-24 (Gambar 4A ) dan 48 (Gambar 4B ) tetapi meningkatkannya pada jam ke-72 (Gambar 4C ). Pemberian antagonis reseptor 5-HT7 secara signifikan menghambat sel KATO-III dalam cara yang bergantung waktu (Gambar 4D ).

GAMBAR 4
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Efek dosis 10⁻⁶ M agonis reseptor 5-HT7 (LP44) dan antagonis (SB-269970) pada proliferasi sel bergantung waktu dalam lini sel KATO-III pada 24 (A), 48 (B), dan 72 (C) jam, bersama dengan kelompok kontrol dan indeks sel bergantung waktu (D). Hasilnya dievaluasi menurut uji Tukey. * p  < 0,05, ** p  < 0,01, *** p  < 0,001 menunjukkan tingkat signifikansi dibandingkan dengan kelompok kontrol.
3.3 Antagonisme Reseptor 5-HT7 Memperbaiki GC dengan Mempengaruhi Regulasi Gen Apoptotik
Kami mengamati bahwa pemberian agonis menurunkan ekspresi reseptor 5-HT7 (Gambar 5A ) dan meningkatkan aplikasi antagonis dalam investigasi pada sel KATO-III. Selain itu, ekspresi mRNA NF-kB (Gambar 5C ), yang berkontribusi pada perkembangan kanker, tidak mengalami perubahan signifikan dengan pemberian agonis tetapi menurun dengan pemberian antagonis. Memperbaiki mekanisme pertahanan antikanker tubuh, BAX (Gambar 5B ), CAS-3 (Gambar 5D ), dan CAS-9 (Gambar 5 ). Ekspresi mRNA oleh antagonis mendukung kemungkinan efek antikanker reseptor 5-HT7 dengan antagonis (Gambar 5E ).

GAMBAR 5
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Analisis ekspresi mRNA 5-HTR7 (A), BAX (B), NF-kB (C), CAS-3 (D), dan CAS-9 (E) dari sel KATO-III. Hasilnya dievaluasi menurut uji Tukey. * p  < 0,05, ** p  < 0,01, *** p  < 0,001 menunjukkan tingkat signifikansi dibandingkan dengan kelompok kontrol.
3.4 Antagonis Reseptor 5-HT7 Mengurangi Viabilitas Sel dan Memperbaiki Gangguan Apoptosis pada Lini Sel KATO-III
Pewarnaan Hoechst 33258 pertama kali digunakan untuk menunjukkan apoptosis pada sel KATO-III. Ketika diperiksa di bawah mikroskop fluoresensi, apoptosis signifikan dengan aglutinasi kromatin dan kariopiknosis diamati pada kelompok ANTA (Gambar 6A ). Pada kelompok kontrol, sel dan nukleusnya normal. Uji pelabelan ganda Annexin V/PI dilakukan dan dianalisis dengan flow cytometry untuk menunjukkan secara meyakinkan bahwa kematian sel yang disebabkan oleh antagonis reseptor 5-HT7 adalah apoptosis. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6B , kelompok ANTA memiliki persentase sel apoptosis yang lebih signifikan daripada LP-44. Meskipun sel apoptosis terdapat pada kelompok AGO + ANTA, tingkat apoptosis ini lebih rendah daripada kelompok ANTA. Hasil ini mendukung bahwa antagonis reseptor 5-HT7 dapat menginduksi apoptosis pada sel KATO-III (Gambar 6B ).

GAMBAR 6
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Temuan mikroskop fluoresensi setelah pewarnaan Hoechst 33342 pada sel GC KATO-III (A). Kadar Apoptosis Annexin V/PI KATO-III 24 jam (B). AGO: LP44 (10⁻⁶ M), ANTA: SB-269970 (10⁻⁶ M).
Hasil Imunohistopatologi Pasien 3,5 GC
Pada hasil pewarnaan imunohistokimia dengan antibodi reseptor 5-HT7, pewarnaan pada tingkat yang berbeda diamati pada sampel jaringan FFPE yang dipilih. Menurut hasil pewarnaan, kekuatan dan intensitas pewarnaan pada sel tumor lemah (Gambar 7A–C ). Tidak ada pewarnaan pada sel tumor, sedangkan sel inflamasi yang berdekatan menunjukkan pewarnaan (Gambar 7D ).

GAMBAR 7
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Hasil imunohistokimia dari potongan perut yang diwarnai dengan reseptor 5-HT7 Ab dengan sel tumor (A–C) dan sel inflamasi (D) (Bintang: pewarnaan imun kuat, bulat: pewarnaan imun lemah).

4 Diskusi
Patogenesis dan perkembangan GC melibatkan interaksi rumit dari banyak faktor, yang menjadikannya sebuah proses yang kompleks. Saat ini, GC merupakan salah satu tumor ganas yang paling umum, yang menimbulkan beban kesehatan global yang signifikan. Meskipun ada kemajuan dalam deteksi dini dan pendekatan pengobatan standar, angka kematian yang terkait dengan GC tetap sangat tinggi [ 25 ]. Salah satu tantangan dalam mendiagnosis garis GC adalah gejala gastrointestinalnya yang beragam dan tidak spesifik, yang dapat dengan mudah meniru kondisi jinak seperti refluks gastroesofageal atau penyakit tukak lambung, yang berpotensi menyebabkan diagnosis yang terlewatkan. Oleh karena itu, riwayat medis yang komprehensif harus diperoleh dengan cermat ketika mengevaluasi pasien yang diduga menderita GC dan menunjukkan kemungkinan faktor risiko seperti penurunan berat badan yang tidak dapat dijelaskan, perdarahan, rasa terbakar di epigastrium, kehilangan nafsu makan, muntah, nyeri, atau ketidaknyamanan. Ini harus dilengkapi dengan pemeriksaan fisik menyeluruh dan, khususnya, endoskopi, dengan mempertimbangkan faktor sosial juga [ 26 ].

Sementara pasien yang didiagnosis dengan tumor ganas karsinoid penghasil serotonin di jejunum, ileum, dan sekum biasanya memiliki prognosis yang baik dengan harapan hidup yang panjang, perkembangan tumor dapat terwujud lebih cepat dalam kasus-kasus tertentu [ 27 ]. Menariknya, penelitian telah mengungkapkan bahwa peningkatan serotonin dalam berbagai sel tumor, termasuk kanker prostat, pankreas, paru-paru, dan usus besar, merangsang pertumbuhan tumor [ 28 ], sementara antagonis menunjukkan efek penghambatan pada sel-sel ini [ 29 ]. Akibatnya, farmakoterapi yang menargetkan reseptor serotonin telah menjadi jalan terapeutik yang potensial. Meskipun demikian, data terbatas telah tersedia tentang keterlibatan serotonin dalam migrasi sel kanker dan proses metastasis. Meskipun jalur langsung regulasi serotonin dan proliferasi tumor hanya ditetapkan pada karsinoid tertentu [ 30 , 31 ], serotonin telah diidentifikasi sebagai penanda tumor untuk karsinoid gastrointestinal dan, sampai batas tertentu, karsinoid bronkial, hati, dan ovarium [ 32 ]. Lebih jauh lagi, strategi terapi yang melibatkan penghambatan transporter serotonin dan modulasi sintesis serotonin menggunakan inhibitor reuptake serotonin selektif (SSRI) juga telah dieksplorasi.

Terutama terletak di thalamus dan hipotalamus, reseptor 5-HT7 berdiri sebagai salah satu anggota yang lebih baru diidentifikasi dalam keluarga reseptor serotonin [ 33 , 34 ]. Meskipun fungsinya belum sepenuhnya dijelaskan, keberadaannya juga telah diamati di pinggiran, khususnya pada sel otot polos pembuluh darah [ 33 , 35 ], serta di saluran pencernaan [ 33 ], di mana ia berperan dalam mengatur [ 36 ]. Khususnya, studi tertentu telah menyarankan bahwa agonis reseptor 5-HT7 dapat mengurangi tonus fundus lambung, tetapi dampak antagonis reseptor 5-HT7 pada akomodasi lambung masih harus dieksplorasi [ 37 ]. Studi ini menunjukkan bahwa reseptor 5-HT7 dikaitkan dengan proliferasi dalam garis sel GC dan KATO-III. Lebih jauh lagi, hal itu menetapkan bahwa proliferasi dalam garis sel ini dihambat dengan penerapan antagonis reseptor 5-HT7, yang memengaruhi jalur apoptosis.

Selain menjadi neurotransmitter, 5-HT memiliki fungsi fisiologis penting sebagai hormon dalam sistem gastrointestinal [ 38 ]. 5-HT memperbanyak berbagai sel tumor (jenis karsinoma, karsinoid, dll.) [ 39 ]. 5-HT paling menonjol dikaitkan dengan sindrom karsinoid, yang dinamakan tumor karsinoid dengan mengeluarkan beberapa faktor. Meskipun asam 5-hidroksiindolasetat (5-HIAA), produk pemecahan 5-HT yang diekskresikan dalam urin, sering digunakan sebagai penanda dalam diagnosis dan tindak lanjut pasien dengan sindrom karsinoid, ekskresi 5-HIAA urin juga telah dikaitkan dengan prognosis dan tingkat keparahan penyakit jantung karsinoid pada pasien tersebut [ 40 ]. Studi kami menunjukkan bahwa kadar ekspresi mRNA reseptor 5-HT7 secara signifikan lebih tinggi dalam bahan yang diperoleh dari jaringan FFPE yang didiagnosis dengan GC serta dalam jaringan kanker lambung segar dibandingkan dengan kontrol, yang baik untuk meningkatkan kadar serotonin dalam jaringan tumor. Penelitian sebelumnya telah mengamati ekspresi reseptor 5-HT7 pada sel kanker payudara MDA-MB-231 [ 39 ]. Selain itu, ekspresi reseptor 5-HT HTR2B ditemukan meningkat secara signifikan pada jaringan adenokarsinoma lambung manusia dibandingkan dengan jaringan nontumor [42]. Namun, efek 5-HT7 pada jaringan lambung, sel GC primer, dan lini sel KATO-III belum pernah diselidiki. Dalam penelitian kami, keberadaan reseptor serotonin 5-HT7 pada jaringan lambung, sel GC primer, dan lini sel KATO-III, efek agonis dan antagonis reseptor ini pada lini sel ini diselidiki sebagai tingkat proliferasi dan ekspresi mRNA.

Beberapa studi lini sel kanker (net bronkopulmonalis tipikal (NCIH727), NET bronkopulmonalis atipikal (NCI-H720), NET usus halus (KRJ-I), dan lini sel karsinoid pankreas manusia (BON)) telah menunjukkan efek proliferatif serotonin [ 41 , 42 ]. Studi terkini menyelidiki peran proliferasi autokrin serotonin dalam sel karsinoid manusia, reseptor 5-HT1A, 1B pada tumor pankreas, dan reseptor 5-HT2 pada NET bronkopulmonalis dan NET usus halus [ 39 ]. Dalam studi lain, SB-26997 terbukti memiliki efek antiproliferatif pada lini sel kanker payudara [ 43 ]. Demikian pula, dalam studi terkini kami, baik agonis reseptor 5-HT7 yang memberikan efek proliferatif maupun antagonis reseptor 5-HT7 menunjukkan efek penghambatan pada sel GC primer maupun lini sel KATO-III. Ada juga beberapa publikasi yang melaporkan peran regulasi 5-HT7 dalam ekspresi protein dan reseptor lain [5, 22, 46]. Agonis dan antagonis reseptor 5-HT7 dapat memengaruhi ekspresi reseptor melalui kaskade pensinyalan intraseluler. Kaskade ini melibatkan pembawa pesan kedua, protein kinase, dan faktor transkripsi yang memodulasi ekspresi gen. Dengan demikian, reseptor dapat diatur naik atau turun dengan adanya agonis atau antagonis. Mekanisme pengaturan ini memungkinkan sel untuk menyesuaikan sensitivitasnya terhadap sinyal eksternal dan menjaga keseimbangan fisiologis dalam menanggapi berbagai tingkat aktivasi reseptor [ 43 ].

BAX, anggota keluarga Bcl-2, adalah protein proapoptotik multidomain yang memainkan peran penting dalam jalur apoptosis intrinsik. Stimulasi gerakan kematian menyebabkan perubahan konformasi pada BAX, yang kemudian bergerak dari sitoplasma ke mitokondria, sehingga mengakhiri peristiwa tersebut dengan apoptosis mitokondria [ 44 ]. Protein Bcl-2 secara ketat mengendalikan aktivitas proapoptotik BAX. Rasio BAX/Bcl-2 sangat penting untuk memicu apoptosis intrinsik karena Bcl-2 membentuk heterodimer dengan BAX dan menghambat oligomerisasi BAX pada membran luar mitokondria [ 45 ]. Studi kami menunjukkan bahwa kadar mRNA BAX berubah dengan penerapan antagonis reseptor 5-HT7 pada sel KATO-III.

NF-kB, penanda apoptosis lain dalam sel kanker, memiliki peran dalam banyak kejadian, termasuk proliferasi sel, apoptosis, angiogenesis, respons imun, adhesi sel, dan diferensiasi [ 46 ], dan kadar NF-kB yang tinggi telah dilaporkan dalam kejadian ini [ 47 – 49 ]. Studi telah melaporkan bahwa NF-kB diaktifkan secara konstitutif dalam jaringan karsinoma lambung [ 50 ]. Sebaliknya, dalam studi lain, Kwon HC et al. menunjukkan peningkatan ekspresi NF-kB dalam jaringan GC manusia [ 51 ]. Mendukung semua informasi ini, telah dikonfirmasi bahwa menghambat NF-kB dapat meningkatkan apoptosis GC [ 52 ], kanker tiroid [ 53 ], sel kanker payudara, dan sel tumor lainnya [ 54 ]. Menurut hasil kami, tingkat ekspresi mRNA NF-kB menurun dalam sel KATO-III dengan penerapan antagonis reseptor 5-HT7 dengan cara yang sama seperti dalam studi saat ini.

Faktor penting lain dalam apoptosis selama ontogenesis dan homeostasis pada organisme multiseluler adalah enzim CAS-3. Oleh karena itu, enzim ini merupakan target obat yang penting dan potensial dalam penelitian kanker [ 55 ]. CAS-9 yang teraktivasi memecah pro-CAS-3 menjadi bentuk aktifnya, yang menginduksi apoptosis sel [ 56 ]. Studi lini sel GC SGC7901/ADR menyatakan bahwa aktivitas CAS-3 dan CAS-9 telah meningkat [ 57 ]. Hasil kami juga menunjukkan bahwa peningkatan aktivasi caspase dikaitkan dengan peningkatan ekspresi BAX. Ekspresi mRNA CAS-3 dan CAS-9 meningkat secara signifikan pada sel KATO-III dengan pemberian antagonis reseptor 5-HT7.

Selain temuan kami saat ini, kami menunjukkan viabilitas sel, apoptosis, dan nekrosis lini sel KATO-III menggunakan flow cytometry dan teknik Hoechst 33258. Analisis temuan flow cytometry KATO-III mengungkapkan penurunan 79,83% pada sel KATO-III yang hidup setelah pemberian antagonis saja. Hasil ini menunjukkan bahwa antagonis reseptor 5-HT7 mengurangi proliferasi pada lini sel KATO-III. Ia juga memperbaiki apoptosis yang terganggu pada sel KATO-III dan menginduksi apoptosis pada 14%. Namun, jalur apoptosis tidak berfungsi secara efektif dengan pemberian agonis reseptor 5-HT7 dan antagonis reseptor 5-HT7 secara bersamaan. Selain itu, hasil pewarnaan Hoechst 33258 menunjukkan bahwa antagonis reseptor 5-HT7 menginduksi pembentukan jaringan kromatin padat. Perubahan kumpulan gen apoptotik dan antiapoptotik yang kami temukan setelah analisis RT-PCR juga didukung oleh hasil apoptosis dalam flow cytometry dan pewarnaan Hoechst 33258 yang menunjukkan bahwa reseptor 5-HT7 dalam lini sel lambung mungkin memiliki peran penting dalam pembentukan atau patogenesis kanker. Dalam studi kultur, pemberian agonis reseptor 5-HT7 selanjutnya meningkatkan proliferasi dan ekspresi reseptor dalam lini sel KATO-III. Pemberian antagonis juga menurunkan proliferasi lini sel dan secara positif memengaruhi parameter seperti NF-kB, BAX, CAS-3, dan CAS-9, yang dianggap berkontribusi terhadap patogenesis kanker.

Dalam penelitian ini, pengobatan dengan antagonis reseptor 5-HT7 SB-269970 menghasilkan, untuk pertama kalinya, penurunan signifikan dalam ekspresi reseptor 5-HT7 pada sel GC dan KATO-III, bersamaan dengan efek yang menginduksi apoptosis. Seperti yang diharapkan, penghambatan reseptor 5-HT7 dengan SB-269970 menghasilkan penurunan yang nyata dalam proliferasi sel pada sel GC dan KATO-III. Hasil ini didukung oleh pengamatan berikut: (1) Ekspresi mRNA reseptor 5-HT7 meningkat pada jaringan GC dibandingkan dengan jaringan lambung yang sehat. (2) Proliferasi sel GC dan KATO-III menurun secara bergantung waktu setelah pemberian SB-269970. (3) Aplikasi SB-269970 meningkatkan ekspresi mRNA gen terkait apoptosis, termasuk CAS-3, CAS-9, dan BAX. (4) Insiden apoptosis meningkat dengan adanya Annexin V/PI, terutama setelah pemberian SB-269970. Selain itu, pembentukan jaringan kromatin padat telah diamati melalui penggunaan pewarnaan Hoechst 33342.

Studi ini memiliki dua keterbatasan utama. Pertama, peningkatan ekspresi gen umumnya menunjukkan peningkatan yang sesuai pada produk akhir; namun, hasil ini mungkin tidak secara akurat mencerminkan ekspresi protein pensinyalan terkait. Idealnya, kami akan menunjukkan perubahan dalam ekspresi protein, tetapi kami tidak dapat melakukannya karena ketersediaan protein yang tidak mencukupi dan kendala anggaran. Kedua, kami hanya menilai SB-269970 sebagai antagonis reseptor 5-HT7 dan LP-44 sebagai agonis; banyak ligan potensial lainnya untuk reseptor ini memerlukan penyelidikan lebih lanjut.

5 Kesimpulan
Singkatnya, antagonis reseptor 5-HT7 melemahkan pertumbuhan dan proliferasi sel baik pada sel GC primer maupun lini sel KATO-III dengan mengatur jalur apoptosis. Peningkatan mekanisme pertahanan antikanker tubuh melalui pengaturan ekspresi BAX, CAS-3, dan CAS-9 melalui antagonisme reseptor 5-HT7 mendukung kemungkinan efek antikanker antagonis 5-HT7. Namun, diperlukan penelitian in vivo dan in vitro lebih lanjut, serta investigasi klinis, untuk mengeksplorasi mekanisme kerjanya. Penelitian selanjutnya harus menyelidiki peran reseptor 5-HT7 pada jenis GC lain dan kasus klinis, yang mengonfirmasi efektivitas antagonisme reseptor ini dalam pengobatan kanker. Penelitian ini menunjukkan bahwa reseptor 5-HT7 harus dievaluasi sebagai target potensial dalam onkologi, karena reseptor tersebut dapat memungkinkan pendekatan baru untuk mengobati kanker lambung (GC). Selain itu, antagonisme reseptor ini dapat dieksplorasi sebagai protokol terapi antikanker yang potensial.