Abstrak
Penyakit dan kelainan jaringan gigi, mulut, dan kraniofasial (DOC) merupakan beban kesehatan global yang signifikan dan telah ditemukan memiliki prevalensi dan insidensi terstandar usia terbesar dari semua penyakit yang dilaporkan di seluruh dunia. Sementara penerapan terapi baru telah disarankan untuk mengatasi berbagai jenis penyakit kesehatan mulut, hanya sejumlah kecil terapi regeneratif intervensional yang dilaporkan dapat meningkatkan hasil terapi klinis. Kurangnya terapi baru dalam regenerasi jaringan DOC mungkin sebagian disebabkan oleh jalur translasi yang sangat intensif sumber daya dari model praklinis ke uji klinis. Baru-baru ini, para pemangku kepentingan dan badan pengatur telah mulai mendorong penggunaan model praklinis alternatif yang menggunakan jaringan manusia untuk menguji intervensi terapeutik sebagai pengganti model hewan. Advokasi ini dapat memberikan kesempatan untuk mengurangi atau menghilangkan pengujian hewan, yang pada akhirnya membatasi pengeluaran sumber daya dan menyediakan jalur peraturan yang lebih efisien untuk persetujuan terapi DOC baru. Meskipun kompleksitas fisiologi, cacat, dan penyakit DOC tidak dirangkum secara efektif dalam model kultur in vitro 2D atau 3D tradisional, kemunculan model in vitro yang lebih canggih (atau yang disebut sistem mikrofisiologi yang mencakup sistem spheroid, organoid, dan organ on-chip (OoC)) telah memungkinkan pemodelan yang efektif dari kondisi penyakit yang disimulasikan secara klinis dalam beberapa jaringan dan sistem organ DOC. Di sini, kami bertujuan untuk memberikan gambaran umum dan perbandingan kolektif dari sistem mikrofisiologi ini, menguraikan penggunaan terkini mereka dalam penelitian DOC, dan mengidentifikasi kesenjangan penting dalam pemanfaatan dan kemampuan mereka untuk merangkum fitur penting fisiologi oral-kraniofasial asli, untuk memungkinkan kinerja terapeutik intervensi de novo yang ditargetkan pada hasil regenerasi in vivo.

Pernyataan Dampak Translasi
Biomaterial DOC dan strategi regeneratif saat ini kurang terwakili dalam literatur bioteknologi dan rekayasa jaringan—meskipun insiden penyakit jaringan tersebut memiliki prevalensi standar usia tertinggi di seluruh dunia. Tujuan dari karya ini adalah untuk menyoroti bidang subjek ini melalui tinjauan sistem mikrofisiologis kontemporer dalam pengembangan terapi dan bagaimana teknologi baru ini dapat digunakan untuk meningkatkan jalur pengembangan terapi dalam regenerasi jaringan DOC.

1 PENDAHULUAN JARINGAN DAN PENYAKIT KRANIOFASIAL GIGI MULUT
Kompleks gigi, mulut, dan kraniofasial (DOC) merupakan kelompok heterogen dari relung jaringan yang saling berhubungan yang terdiri dari gigi-geligi, dengan periodonsium yang berfungsi menyokong gigi, dan kompleks kraniofasial yang meliputi tulang, tulang rawan, ligamen, otot, serta jaringan saraf tepi, pembuluh darah, pembuluh limfatik, dan kelenjar pendukung lainnya.

Penyakit dan gangguan jaringan DOC merupakan beban global yang signifikan dan telah terbukti memiliki prevalensi dan insidensi terstandar usia terbesar di seluruh dunia. 1 , 2 Perawatan tahunan penyakit mulut, secara independen, telah diperkirakan mencapai >$350 miliar USD dalam biaya langsung dan mewakili hampir 5% dari pengeluaran perawatan kesehatan global. Selain konsekuensi langsung dari penyakit dan gangguan DOC yang membahayakan kualitas hidup dan kesejahteraan individu, 3 kondisi penyakit kronis jaringan mulut (seperti periodontitis) telah semakin dikaitkan dengan lebih dari 60 penyakit sistemik, termasuk penyakit kardiovaskular, diabetes, kanker, pneumonia, penyakit radang usus, obesitas, kelahiran prematur, dan penyakit Alzheimer. 4 – 7

Khusus untuk jaringan yang memerlukan intervensi regeneratif untuk mengatasi kebutuhan klinis, telah disarankan agar pendekatan rekayasa biologis dan rekayasa jaringan baru lebih ditekankan dalam pekerjaan model pra-praklinis. Terapi kontemporer tersebut didasarkan pada aspek dasar rekayasa dan regenerasi jaringan, termasuk mengelola interaksi perancah jaringan, molekul pensinyalan/faktor pertumbuhan, dan/atau pengiriman sel langsung untuk perekrutan sel endogen atau mediator. Terapi yang muncul dalam DOC mencakup, misalnya, perancah biomaterial yang merangkum arsitektur asli jaringan target dengan lebih baik menuju penyembuhan dan integrasi yang lebih baik, 8 , 9 pengiriman biologis yang disetujui secara klinis (yaitu, rhPDGF-BB, 10 , 11 rhBMP-2, 12 – 14 rhFGF-2, 15 turunan matriks email 16 ), yang mengatasi kaskade inflamasi serta perbaikan atau regenerasi jaringan DOC yang sakit atau rusak, 17 – 19 dan terapi gen seluler 20 , 21 yang memanipulasi progenitor endogen menggunakan vektor yang dimuat gen untuk menghasilkan faktor parakrin pro-regeneratif. Meskipun ada bukti praklinis yang menjanjikan dengan penelitian hewan untuk banyak intervensi biomaterial, biologis, dan seluler yang baru, sejumlah kecil terapi ini tersedia secara klinis untuk mengatasi beban penyakit global, dengan hanya segelintir biologis dan biomaterial yang telah disetujui selama dua dekade terakhir.

Jumlah terapi baru yang rendah untuk regenerasi jaringan DOC yang berhasil digunakan secara klinis sebagian dapat dikaitkan dengan jalur penerjemahan yang membutuhkan banyak sumber daya untuk melakukan intervensi dari model hewan praklinis ke uji klinis; terutama didorong oleh jumlah uji hewan yang diperlukan untuk mengatasi kendala regulasi. 22 Baru-baru ini, para pemangku kepentingan dan badan regulasi telah mendorong penggunaan alternatif untuk model hewan, khususnya model in vitro yang berasal dari manusia, yang dimotivasi oleh perspektif kemanusiaan dan pertanyaan terkait relevansinya sebagai model praklinis untuk kondisi penyakit manusia. 23 Beberapa penelitian kini menunjukkan bahwa hasil terapi regeneratif yang terkait dengan penelitian pada hewan mungkin tidak dapat memprediksi dengan baik kemanjuran terapeutik pada manusia, terutama dalam kasus terapi biologis baru yang menyelidiki modifikasi gen atau penargetan antigen dalam sel manusia. 24 , 25 Dorongan untuk model in vitro praklinis alternatif ini telah diakui secara langsung oleh Undang-Undang Modernisasi Badan Pengawas Obat dan Makanan AS (FDA) tahun 2021 dan Undang-Undang Penelitian dan Pengujian yang Manusiawi (HR 1744). Seruan ini dapat memberikan peluang untuk mengurangi atau menghilangkan pengujian pada hewan, yang pada akhirnya mengurangi pengeluaran sumber daya dan menyediakan jalur regulasi yang lebih efisien untuk persetujuan terapi DOC baru—mengikuti jalur yang menjanjikan yang diadopsi di bidang klinis regenerasi jaringan lainnya. 26

Karena sifat jaringan DOC yang beragam dan saling berhubungan, cacat dan penyakit tidak dirangkum secara efektif dalam model kultur in vitro 2D atau 3D tradisional. Munculnya model in vitro yang lebih canggih (termasuk sistem spheroid, organoid, dan organ on-chip (OoC)) telah memungkinkan pemodelan yang lebih efektif dari keadaan penyakit yang mewakili secara klinis dalam beberapa sistem jaringan dan organ secara keseluruhan. 23 Spheroid adalah agregat sel yang dirakit sendiri yang mengatasi aspek-aspek interaksi sel-sel dan sel-ECM yang terbatas yang terkait dengan metode kultur tradisional. Organoid memiliki pola agregat 3D yang sama dari sistem spheroid sambil menyertakan gugus kompleks sel-sel spesifik organ, yang dapat lebih sesuai untuk menyelidiki interaksi sel-sel heterogen dan pensinyalan parakrin atau mempelajari organogenesis jaringan. Sistem on-chip mencakup semua fitur sistem spheroid dan organoid sambil memperkenalkan mikrofluida dinamis, yang dapat digunakan untuk menggabungkan beberapa sistem sel, jaringan, atau organ untuk meniru fungsi fisiologis dengan lebih dekat. Secara bersamaan, model in vitro (atau sistem mikrofisiologi) yang canggih tersebut dapat dirancang untuk memberikan tingkat tiruan klinis yang tinggi karena memungkinkan penggunaan sel manusia dan sel patologis yang sehat serta ECM-nya. Parameter ini dapat bermanfaat dalam pemodelan interkoneksi berbagai jaringan DOC—mengingat bahwa cacat dan penyakit sering kali terdiri dari asal etiologi yang luas dan menghadirkan patologi kaskade dan gejala sisa yang unik.

Meskipun ada beberapa ulasan yang menyediakan analisis terperinci untuk masing-masing teknologi dan fitur desain yang terkait dengan tiga sistem mikrofisiologi individual di atas secara independen, ketika dipertimbangkan untuk digunakan dalam rekayasa jaringan DOC, 27 – 29 tujuan dalam ulasan saat ini adalah untuk membangun wawasan yang lebih dalam tentang laporan-laporan ini, dan yang lebih penting untuk menyediakan perbandingan sistem mikrofisiologi ini satu sama lain, menguraikan penggunaan mereka saat ini dalam penelitian DOC, dan mengidentifikasi kesenjangan saat ini dalam pemanfaatan mereka dan kemampuan mereka untuk merangkum fitur-fitur penting dari fisiologi asli. Ini dilakukan untuk menilai kemampuan mereka untuk memprediksi regenerasi dan hasil kinerja terapeutik ketika diterapkan pada manusia secara in vivo. Ulasan ini juga akan memberikan pandangan prospektif tentang penggunaan sistem kultur mikrofisiologi ini dan potensinya untuk meningkatkan jalur pengembangan terapeutik untuk regenerasi jaringan DOC.

2 DI LUAR BUDAYA 3D STATIS—RINGKASAN SISTEM IN VITRO KONTEMPORER
Sebelum model hewan dan praklinis, kultur sel statis dua dimensi (2D atau satu lapis), di mana sel dikultur pada substrat datar dan kaku, secara tradisional telah digunakan untuk memodelkan sejumlah proses biologis dan penyakit yang ditargetkan secara in vitro. Sementara kultur sel statis 2D menyajikan platform yang terstandarisasi dan hemat biaya untuk penyaringan terapeutik awal dengan hasil tinggi, sel yang dikultur dengan cara ini telah terbukti kurang mewakili morfologi, organisasi, dan perilaku in vivo mereka. Bukti yang mendukung perbedaan ini telah dijelaskan sejak tahun 1980-an, mengikuti karya Bissel dkk. yang menyoroti pentingnya matriks ekstraseluler (ECM) dan lingkungan mikro pada perilaku sel mamalia. 30 Sebagai hasil dari temuan ini, telah diterima secara luas bahwa isyarat arsitektur, mekanis, dan biokimia spesifik jaringan yang esensial hilang dalam kondisi kultur 2D, yang mengakibatkan bukti respons in vivo yang tidak prediktif dan menyesatkan. 31 – 33

Untuk meningkatkan relevansi fisiologis pengujian berbasis sel, metode kultur tiga dimensi (3D) telah diadopsi yang memodelkan lingkungan mikro spasial sel mamalia dengan lebih baik. Memang, sel yang dikultur 3D telah terbukti mempertahankan perilaku sel-sel dan sel-ECM yang lebih relevan secara biologis jika dibandingkan dengan kultur 2D, termasuk adhesi dan migrasi sel yang lebih representatif, morfogenesis, ekspresi gen, dan pemeliharaan fenotipe spesifik jaringan yang terdiferensiasi. 34 Kultur 3D dapat didukung oleh dukungan seperti ECM (atau perancah/matriks) atau melalui agregasi sel yang diinduksi atau alami dalam suspensi atau lingkungan yang tidak melekat. Berbagai jenis sistem kultur 3D kontemporer mencakup model sferoid, organoid, dan on-chip yang mewakili hierarki simulasi dan kompleksitas mikrofisiologis. Tinjauan umum sistem model ini dijelaskan di bawah ini dan diringkas dalam Gambar 1 .
GAMBAR 1
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Keunggulan, kelemahan, dan fitur utilitas utama dari model praklinis 2D, spheroid, organoid, dan organ pada chip. Hijau dan merah digunakan untuk mewakili atribut positif dan negatif dari peningkatan kecanggihan model mikrofisiologi. Gambar ini dibuat dengan bantuan www.Biorender.com .

2.1 Sferoid
Spheroid seluler (atau agregat sel) merupakan kelas sistem kultur yang beragam yang telah ada sejak tahun 1970-an. 35 Spheroid terbentuk oleh agregasi sel secara spontan atau paksa, yang diikuti oleh pengikatan integrin permukaan sel ke ECM (atau matriks mirip ECM). Kontak sel-ke-sel dan kepadatan agregat kemudian diatur oleh E-kadherin, yang terakumulasi pada permukaan sel dan mungkin sangat bergantung pada kondisi kultur yang ditentukan, termasuk akses ke nutrisi, oksigen, dan faktor pertumbuhan. 36

Spheroid telah menjadi sangat lazim dalam pemodelan tumor, karena agregat sel sering kali mengandung keterbatasan vaskular dan difusi yang sama dengan tumor, yang diamati secara in vivo. 37 Secara khusus, spheroid tumor multiseluler menunjukkan resistensi kemoterapi yang lebih besar jika dibandingkan dengan sel induk kanker dalam kultur monolayer—sebuah fitur yang membuatnya lebih mirip dengan rekan-rekan in vivo mereka dan dengan demikian menjadi mekanisme model yang lebih berguna untuk resistensi kemoterapi. 38 , 39 Dalam beberapa tahun terakhir, penggunaan spheroid telah diperluas untuk mengeksplorasi beberapa jenis sel dan fisiologi terkaitnya, termasuk sistem muskuloskeletal, saraf, kardiovaskular, pernapasan, dan pencernaan. 40 , 41

Sferoid dapat dibentuk menggunakan beberapa teknik yang menghasilkan morfologi sferoid yang dapat diprediksi dan konsisten. 42 Metode-metode ini mencakup, misalnya, penggunaan pelapisan cairan, labu pemutar, metode tetes gantung, dan yang lebih baru, metode ini dibuat dalam sumur kultur individual untuk analisis berthroughput tinggi, suatu topik yang telah dibahas panjang lebar di tempat lain. 43 – 46

Secara umum, sistem sferoid menghadirkan sarana yang mudah diakses untuk memperluas penerjemahan kultur dan cocok untuk eksplorasi lanjutan ke dalam model organoid dan sistem pada chip yang memperkenalkan aliran.

2.2 Organoid
Model organoid merupakan kelas sistem mikrofisiologis agregat sel yang lebih baru. Fitur pembeda utama antara sferoid dan organoid adalah bahwa organoid mengandung sel-sel spesifik organ yang dapat mengalami diferensiasi dan menampilkan aspek-aspek organogenesis jaringan. Organoid juga telah terbukti memfasilitasi diferensiasi yang lebih baik menjadi populasi sel progenitor yang beragam jika dibandingkan dengan kultur sferoid saja. 47 Dengan cara ini, sistem organoid dapat digunakan untuk memodelkan seluruh jaringan atau arsitektur spesifik organ dengan lebih baik, termasuk batas dan sambungan multiseluler penting yang mendukung fungsi khusus mereka secara in vivo. 48 , 49

Organoid juga dapat direkayasa menggunakan sel-sel organ-spesifik atau sel-sel yang diisolasi langsung dari jaringan pasien, yang memungkinkan replikasi patologi penyakit yang dipersonalisasi dan penyaringan terapeutik berikutnya. Meskipun menyediakan struktur superfisial yang mirip dengan spheroid, pembentukan organoid multiseluler yang direkayasa sering kali menimbulkan kerumitan tambahan pada metode agregat yang dijelaskan di atas, yang dikaitkan dengan modulasi rasio penyemaian kultur bersama dan diferensiasi selektif relung jaringan. Namun, beberapa sistem organoid telah menunjukkan organogenesis spontan dalam kondisi kultur bersama yang lebih mirip dengan metodologi pembentukan spheroid, sehingga mengidentifikasi keterbatasan model-model ini. 50 Organoid juga telah terbukti memiliki kemampuan untuk dipertahankan untuk kultur jangka panjang dan memungkinkan kriopreservasi yang efektif, menunjukkan peningkatan stabilitas genomik dan transkriptomik jika dibandingkan dengan tingkat mutasi sel progenitor yang tinggi dan karenanya berfungsi sebagai model mikrofisiologi yang sangat konsisten. 51 , 52

Secara umum, sistem organoid menyajikan model mikrofisiologi yang diperluas yang bergerak menuju penerapan dan penyaringan penyakit dan terapi khusus pasien. Fitur terakhir membuatnya mudah dieksplorasi lebih lanjut dalam sistem mikrofluida pada chip.

2.3 Organ pada chip
Kemajuan dalam teknik mikrofluida resolusi tinggi (seperti litografi lunak) telah memunculkan pengenalan metode kultur sel “on-chip”.53 Model on-chip tersebut mewakili kelas sistem kultur mikrofisiologis terbaru yang mencakup fitur sistem sferoid dan organoid sekaligus memperkenalkan mikrofluida dinamis yang dilengkapi dengan ruang dan saluran kultur diskret.

Tujuan penambahan aliran dinamis dan desain multisaluran adalah untuk menyediakan model yang lebih representatif dari pertukaran nutrisi fisiologis, eliminasi limbah biokimia, dan rangsangan mekanis yang mengatur fungsi sel secara in vivo. Modulasi gradien limbah/nutrisi dan gaya geser, menggunakan mikrofluida, telah terbukti lebih meningkatkan efisiensi diferensiasi dan kesetiaan organoid sel punca mesenkimal di area rekayasa jaringan lainnya. 54 Fitur unik tambahan dari kultur on-chip adalah kemampuan untuk secara efektif membudidayakan mikrobioma kompleks dengan konstruksi jaringan inang, yang dapat dikultur bersama untuk waktu yang lama (hingga 5 hari) jika dibandingkan dengan kultur bersama dengan organoid saja, yang hanya dapat dipertahankan selama sekitar 6 jam. 55 Studi tentang kedua sel mamalia dalam keadaan patologis dengan mikrobioma sangat relevan dengan studi penyakit mulut dan oleh karena itu akan menjadi aspek penting dari diskusi yang sedang berlangsung dalam artikel tinjauan ini. Lebih jauh lagi, kemampuan tersebut, bersama dengan manfaat lain dari sistem kultur mikrofluida, telah memperluas batasan dari apa yang sebelumnya dianggap mungkin dengan model in vitro, di mana sistem mikrofisiologi tersebut telah digunakan untuk mengembangkan jaringan jantung, hati, dan paru-paru yang “berfungsi”, yang semuanya memiliki kemiripan yang belum pernah terjadi sebelumnya dengan organ modelnya secara in vivo. 23

Desain sistem on-chip dan pembuatannya sudah menjadi subjek tinjauan yang sangat baik oleh Huang et al. 29 Berbeda dengan sistem kultur agregat lainnya, metode on-chip menambah biaya yang cukup besar (peralatan, desain) dan kompleksitas (melalui pengenalan aliran dan desain chip) pada alur kerja pengembangan produk, dan saat ini terbatas pada ketersediaan desain chip untuk jenis jaringan target atau sistem organ. Saat ini, metode on-chip menyajikan cara yang paling lengkap untuk memodelkan fisiologi in vivo yang dapat memberikan fitur fisiologis penting yang dapat meningkatkan validasi pengamatan yang dilakukan dalam kultur agregat.

2.4 Menuju aplikasi dalam DOC
Penerapan sistem kultur mikrofisiologi ini dapat berguna dalam pemodelan sifat kompleks fisiologi DOC secara sistematis. Strategi semacam itu dapat digunakan untuk memvalidasi kemanjuran terapi atau penyakit dalam model yang semakin biorepresentatif, dengan menggunakan setiap jenis model untuk menjawab pertanyaan penelitian independen yang spesifik. Misalnya, secara sistematis, model sferoid sel pulpa gigi dapat digunakan pada awalnya untuk menilai sitotoksisitas resin perekat gigi yang baru. 56 Sebagai perluasan dari pola sferoid, model organoid dapat menggunakan model agregat sel pulpa/endotel gigi, di mana interaksi spesifik daerah pulpa dengan pembuluh darah mikro dan respons terhadap agen sitotoksik dapat divalidasi. 57 Lebih lanjut, pemodelan resin perekat gigi yang sama juga dapat dilakukan pada chip, dan dapat digunakan untuk meniru antarmuka dentin-pulpa fisiologis secara efektif sambil memodelkan keadaan aliran yang ada antara jaringan pulpa gigi dan lingkungan mulut. 58 Sistem seperti itu akan memungkinkan kita untuk mempelajari efek difusif potensial pada pengenceran agen sitotoksik, serta efeknya pada sel dan jaringan lain di hilir tempat mereka diperkenalkan. Bersama-sama, metode ini bertujuan untuk meniru keadaan jaringan fisiologis yang berbeda dengan sebaik-baiknya, yang dapat memberikan jawaban atas apa yang mungkin dapat diamati secara in vivo. Teks berikut dimaksudkan untuk membahas contoh penggunaan model ini dalam DOC (banyak di antaranya dirangkum dalam Tabel 1 ), dan untuk menguraikan seberapa efektif metode ini dapat mendekati emulasi perilaku in vivo untuk jaringan DOC.

TABEL 1. Ringkasan model mikrofisiologi yang digunakan dalam DOC.
3 PEMODELAN JARINGAN DOC DENGAN SPHEROID
Spheroid, seperti yang dibahas di atas, merupakan kelas sistem kultur mikrofisiologi yang paling mudah diakses, mengingat beban sumber dayanya yang relatif rendah dan kemudahan pembuatannya. Dalam penelitian DOC, spheroid telah digunakan untuk memodelkan aspek jaringan lunak mulut, termasuk ligamen periodontal dan mukosa gingiva/mulut. Dalam aplikasi ini, spheroid telah digunakan baik sebagai alat untuk meningkatkan kemanjuran terapi berbasis sel maupun sebagai sistem untuk menyediakan alat skrining terapeutik yang lebih efektif.

3.1 Meningkatkan terapi berbasis sel (regenerasi jaringan)
Pengiriman sel progenitor oral telah dilaporkan sebagai strategi yang berguna untuk membantu dalam remodeling dan regenerasi jaringan. 59 Satu keterbatasan saat ini tetap berupa kontrol garis keturunan diferensiasi dan kapasitas sel progenitor yang dikirimkan secara in vivo. 60 Pengiriman agregat/spheroid sel, dibandingkan dengan yang dikirimkan dari kultur monolayer, telah disarankan sebagai metode untuk meningkatkan kapasitas diferensiasi sel progenitor oral. Populasi sel punca ligamen periodontal (PDLSC) yang diisolasi dan dikultur telah terbukti meningkatkan kapasitas diferensiasinya dalam model spheroid jika dibandingkan dengan kondisi kultur 2D standar. 61 – 63 Dalam contoh lain, Zhang et al. melaporkan pendekatan kultur spheroid untuk mengoptimalkan sifat sel punca dan proses regeneratif yang terkait dengan sel punca mesenkimal yang berasal dari gingiva manusia (GMSC) dalam model murine mukositis oral yang diinduksi kemoterapi. 64 GMSC yang berasal dari sferoid memiliki efikasi terapeutik yang lebih baik jika dibandingkan dengan sel yang diberikan secara bebas, meningkatkan regenerasi lapisan epitel yang terganggu pada lidah yang terkena, dan mengurangi penurunan berat badan yang ditemukan pada kelompok kontrol yang tidak diobati. Temuan ini menunjukkan bahwa kultur sferoid 3D memungkinkan pelestarian stemness dini, dan berpotensi menjadi prasyarat GMSC untuk mitigasi mukositis oral yang lebih baik.

Selain jaringan lunak mulut, sistem sferoid telah digunakan untuk meningkatkan terapi berbasis sel yang terkait dengan jaringan gigi dan maksilofasial. Untuk jaringan dentin, banyak perhatian telah diberikan pada pengembangan sferoid sel induk pulpa gigi (DPSC) dalam bidang endodontik regeneratif, serupa dengan kegunaannya dengan MSC multigaris keturunan dalam aplikasi rekayasa jaringan lainnya. 65 Seperti halnya PDLSC, DPSC telah terbukti menghadirkan kapasitas diferensiasi multigaris keturunan yang lebih unggul dan ekspresi gen diferensial dalam kultur sferoid, jika dibandingkan dengan kultur monolapis. 66 – 68 Sistem sferoid DPSC yang dihasilkan juga telah menunjukkan ekspresi penanda osteo- dan odontoblastik yang lebih tinggi, serta peningkatan mineralisasi dan potensi osteogenik. 69

Dalam jaringan maksilofasial, spheroid telah digunakan untuk meningkatkan kapasitas diferensiasi PDLSC, sel punca yang berasal dari tulang kortikal (CBSC), dan sel punca yang berasal dari sumsum tulang (BMSC) untuk regenerasi tulang. Jika dibandingkan dengan kultur monolayer, Moritani dkk. menemukan bahwa kultur spheroid PDLSC menunjukkan pembentukan tulang de novo yang superior dalam model defek murine. 62 Temuan ini telah direplikasi menggunakan sel punca yang berasal dari tulang kortikal (CBSC) dan sel punca yang berasal dari sumsum tulang (BMSC), di mana transplantasi spheroid telah menghasilkan peningkatan pembentukan tulang dan percepatan penyembuhan tulang in vivo. 70 – 72 Dalam model kultur bersama spheroid, Zhou dkk. menemukan bahwa pengiriman bersama sel stroma sumsum tulang (BMSC) dan sel MLO-Y4 seperti osteosit dalam bentuk spheroid dapat berfungsi untuk lebih meningkatkan regenerasi tulang bebas perancah dalam model ekstraksi gigi murine. 73

3.2 Penyaringan terapeutik (pemodelan tumor)
Penggunaan DOC spheroid untuk penyaringan terapeutik terutama dikaitkan dengan pemodelan tumor, mengingat kemampuan mereka untuk secara efektif merangkum struktur agregat padat tumor yang diamati secara in vivo. 38 , 39 Dalam DOC, lini sel kanker mulut yang dikultur dalam spheroid telah terbukti memiliki lebih banyak karakteristik seperti tumor jika dibandingkan dengan kultur 2D. 74 Selain lebih efektif memodelkan keterbatasan difusi lingkungan mikro tumor, dibandingkan dengan kultur monolayer, spheroid kanker mulut telah terbukti memiliki ekspresi gen dan protein yang lebih relevan secara fisiologis. 74 , 75 Fenotipe kanker yang lebih representatif dari spheroid kanker mulut telah diterapkan sebagai model yang berguna untuk menyaring kemoterapi. Misalnya, Ono et al. menunjukkan bahwa paparan terhadap cisplatin dan cetuximab menimbulkan efek yang berbeda secara signifikan pada lini sel kanker mulut ketika dikultur dalam kondisi kultur spheroid versus monolayer. 76 Efek dari cisplatin dan cetuximab diketahui telah mengubah mekanisme kemosensitivitas dalam kultur spheroid, dengan karakter antitumor dikaitkan dengan pengurangan adhesi sel dan gangguan spheroid (didominasi oleh pelemahan E-kadherin) dan disregulasi ekspresi reseptor faktor pertumbuhan epidermal, yang diekspresikan secara berbeda dalam setiap lini sel kanker mulut dan mendominasi pertumbuhan spheroid 3D dan respons obat.

Spheroid juga telah digunakan untuk memodelkan kanker mulut dalam model xenograft, yang dapat memberikan wawasan tentang perkembangan tumor dan skrining kemoterapi in vivo yang lebih baik. Karsinoma sel skuamosa oral (OCSS), tidak seperti kanker sel basal, paling sering ditandai dengan kurangnya inti tumor nekrotik, yang menunjukkan pemeliharaan ceruk pro-angiogenik. 77 , 78 Untuk memodelkan aspek OSCC ini dengan lebih baik, Choi et al. menggunakan model xenograft tikus OSCC dan menemukan bahwa penggunaan spheroid kanker, jika dibandingkan dengan sel monolayer, menghasilkan volume tumor total yang secara signifikan lebih besar dan meningkatkan angiogenesis di dalam tumor, mengalami sedikit nekrosis. 79 Mengingat strukturnya yang lebih tervaskularisasi, hanya tumor yang berasal dari spheroid yang ditemukan mengalami pengobatan volume yang berkurang secara signifikan dengan cisplatin. Sampai saat ini, model spheroid telah menemukan sedikit aplikasi dalam skrining terapeutik untuk aplikasi DOC, di luar model tumor dan kemosensitivitas. Namun, dalam salah satu contoh tersebut, Colangelo dkk. menggunakan sferoid fibroblas gingiva untuk menilai kemanjuran senyawa polinukleotida-asam hialuronat untuk meningkatkan regenerasi jaringan lunak mulut. 80 Senyawa ini ditemukan dapat menginduksi peningkatan ukuran dan keliling sferoid, dan penurunan sirkularitas sferoid. Semua karakteristik terakhir tidak dapat diamati dalam pekerjaan kultur monolayer berpola sebelumnya. 81

3.3 DOC spheroids: ringkasan
Model sferoid telah dengan jelas menyajikan keuntungan signifikan atas kultur monolayer dalam analisis jaringan DOC, dengan memperkenalkan interaksi sel-sel dan sel-ECM yang lebih relevan jika dibandingkan dengan kultur monolayer tradisional. Metode sferoid saat ini digunakan dalam DOC untuk meningkatkan kapasitas regeneratif terapi berbasis sel dan memodelkan kanker mulut dan kemoterapi. Menariknya, sistem sferoid, hingga saat ini, jarang digunakan untuk menyaring terapi yang ditargetkan pada jaringan keras dentin dan kraniofasial. Kesenjangan ini mungkin mewakili keterbatasan sferoid saat ini saja, untuk mewakili jaringan DOC dengan tepat. Misalnya, sementara Janjic et al. menemukan bahwa struktur sferoid gingiva lebih mirip dengan jaringan gingiva ex vivo jika dibandingkan dengan kontrol monokultur, mereka masih menunjukkan fitur arsitektur yang sangat berbeda, termasuk perlekatannya pada kolagen dan substrat berbasis tulang dan produksi sitokin pro-inflamasi. 82 Sifat jaringan keras DOC yang sangat terorganisasi dan saling berhubungan dengan relung jaringan lunak mungkin cocok untuk direpresentasikan dengan lebih baik dalam sistem multiseluler yang lebih komprehensif, seperti yang dijelaskan dengan organoid di bawah ini.

4 PEMODELAN JARINGAN DOC DENGAN ORGANOID
Organoid memperkenalkan kompleksitas yang lebih luas pada sistem agregat sferoid tradisional melalui penambahan relung multiseluler yang spesifik pada organ. Organoid dapat direkayasa secara in vitro melalui kombinasi jenis sel yang spesifik pada organ atau dikembangkan dari jaringan donor utuh yang terisolasi dan terdiferensiasi. Selain penggunaannya dalam terapi berbasis sel dan penyaringan terapeutik, sistem organoid telah terbukti bermanfaat dalam pemodelan organogenesis dan perkembangan penyakit dalam penelitian DOC. 83

4.1 Pemodelan penyakit dan organogenesis
Jaringan lunak rongga mulut terus-menerus menghadapi tantangan mikroba, di mana fungsi barier dan struktur berlapisnya penting dalam menjaga kesehatan jaringan rongga mulut. Dengan memanfaatkan organoid mukosa rongga mulut multiseluler, Pinnock et al. melaporkan perbedaan signifikan dalam respons terhadap infeksi P. gingivalis jika dibandingkan dengan kultur sel epitel rongga mulut satu lapis. 84 Kelangsungan hidup intraseluler dan pelepasan bakteri P. gingivalis ditemukan meningkat dalam model organoid mukosa (masing-masing 3 dan 4 kali lipat) jika dibandingkan dengan kultur satu lapis, yang dapat dikaitkan dengan arsitektur berlapis-lapis dan pengelupasan sel epitel dalam model organotipik ini. Lebih jauh, profil sitokin antara model organoid mukosa yang terinfeksi dan kultur satu lapis ditemukan berbeda secara signifikan (terutama untuk CXCL8 dan IL-6) yang menunjukkan mekanisme alternatif disregulasi sitokin oleh P. gingivalis terjadi pada organoid mukosa, jika dibandingkan dengan kultur satu lapis, yang dapat menginformasikan studi mekanistik in vivo di masa mendatang.

Dalam penelitian lain, Zhao dkk. mengembangkan model karsinoma sel skuamosa lidah organoid (TSCC) yang memanfaatkan CAL27 dan fibroblas terkait kanker yang diimobilisasi dalam ECM yang berasal dari lidah yang dideselularisasi. 85 Setelah implantasi dalam model murine, organoid TSCC yang terbentuk menunjukkan karakteristik yang menyerupai histopatologi klinis TSCC, termasuk heterogenitas dan fenotipe tumor, yang dapat berfungsi sebagai model yang diperluas untuk karsinoma jika dibandingkan dengan kultur sferoid. Dalam penelitian lain yang bertujuan untuk memodelkan SCC oral dengan lebih baik, Flashner dkk. menghasilkan organoid dari SCC murine atau sel preneoplastik secara eks vivo melalui pengobatan dengan 4NQO (agen genotoksis yang diketahui). Organoid ini ditemukan menangkap beberapa fitur penting yang menonjol dari ESCC dan preneoplasia esofagus dan berpotensi dimanfaatkan untuk membentuk model isogenik. 86

Selain strategi organoid yang direkayasa, di mana sel-sel organotipik digabungkan secara eks vivo, organoid dapat dibentuk melalui isolasi dan pemurnian langsung dari jaringan mulut donor. Dengan menggunakan strategi ini, Yoshimoto dkk. membuat sistem kultur organoid yang berasal dari kelenjar ludah manusia, yang mampu memodelkan peradangan kelenjar ludah. ​​87 Model tersebut mengembangkan pembengkakan organoid yang diinduksi dan memberikan wawasan mekanistik tentang peran TNF-alfa pada peradangan dan disfungsi kelenjar ludah asli. Organoid yang berasal dari pasien atau donor tersebut dapat menghasilkan wawasan lebih lanjut tentang perkembangan dan pemodelan penyakit khusus pasien, menuju pengembangan pengobatan yang dipersonalisasi. Misalnya, berbeda dengan struktur sel epitel murni dari sistem sferoid OSCC, OSCC yang dibiopsi pasien dan organoid yang diformulasikan mengandung karakter penanda biomolekuler terkait imun, vaskular, dan stroma tambahan, yang merangkum penyakit tersebut secara genetik, histologis, dan fungsional. 88

Fitur unik dari sistem agregat organoid adalah potensinya untuk memodelkan organogenesis, yang dapat menghasilkan wawasan tentang proses perkembangan jaringan DOC yang kompleks. Dalam jaringan gigi, organoid benih gigi telah dikembangkan dan digunakan untuk mempelajari aspek perkembangan gigi manusia yang sebelumnya tidak diketahui. 27 Investigasi semacam itu terhadap organogenesis gigi secara khusus telah menghasilkan wawasan baru tentang jalur pensinyalan (seperti pensinyalan Notch dan TGF-beta) yang mengatur pembentukan gigi secara in vivo. 89 , 90 Untuk jaringan lunak mulut, sel punca yang direkayasa juga telah digunakan untuk mengembangkan model organogenesis kelenjar ludah, di mana faktor ceruk sekresi yang sebelumnya tidak diketahui diidentifikasi terkait dengan pematangan dan diferensiasi jaringan dari ektoderm mulut. 91 , 92

4.2 Skrining terapeutik
Dibandingkan dengan kultur agregat sferoid, sistem organoid dapat memberikan utilitas yang lebih baik dalam penyaringan terapi melalui penyajian batas dan sambungan multiseluler yang penting, serta spesifisitas pasien/donor yang tidak secara efektif dirangkum dalam kultur sferoid dan monolapis.

4.2.1 Peningkatan arsitektur multiseluler
Dalam mengeksplorasi kegunaan organoid ini untuk memodelkan jaringan gigi, Xu dkk. menyelidiki efek diferensial dari agen pelapis kalsium silikat endodontik pada organoid pulpa gigi yang direkayasa dan kultur monolayer.57 Dalam model ini, organoid yang direkayasa menggunakan sel pulpa gigi manusia ( hDPC ) dan sel endotel (EC) dengan (dan tanpa) matriks ekstraseluler pulpa gigi manusia (hDP-ECM). Penelitian ini menemukan bahwa biokompatibilitas diferensial dan potensi osteoinduktif diekspresikan secara unik dalam model organoid pulpa gigi versus kultur monolayer, meskipun keduanya menunjukkan odontogenesis mineralisasi yang relevan secara fisiologis sebagai respons terhadap agen pelapis. Namun, model ini tidak meniru isyarat biofisik dari antarmuka dentin-pulpa, model ini memang merupakan platform yang menjanjikan untuk penyaringan obat dan pengembangan bahan restoratif.

Selain jaringan dentin, model jaringan lunak oral telah digunakan untuk menyelidiki dampak perifer dari perawatan kanker oral. Guo dkk. merekayasa organoid kuncup pengecap untuk mengeksplorasi dampak perawatan radiasi pada disfungsi pengecapan. 93 Dalam mengeksplorasi terapi perlindungan yang sedang berkembang, penelitian ini menemukan bahwa perawatan organoid kuncup pengecap dengan inhibitor SIRT1 dapat meningkatkan kelangsungan hidup sel induk kuncup pengecap Lgr5+ dan mengurangi mukositis lidah yang disebabkan oleh radiasi. Dalam penelitian lain, Serrano-Martinez dkk. menyelidiki dampak radioterapi pada organoid kelenjar ludah dalam induksi xerostomia terkait hiposalivasi. 94 Model organoid kelenjar ludah murine ini terbukti menunjukkan kapasitas ekspansi dan diferensiasi jangka panjang, yang menyediakan platform untuk mempelajari kurva dosis-respons radiasi.

4.2.2 Asal dan spesifisitas pasien
Organoid yang berasal dari pasien dan donor telah terbukti sangat mirip dengan organoid donor terkait, yang memungkinkan penyaringan terapi spesifik pasien yang efektif di luar DOC. 95 – 98 Penggunaan organoid yang berasal dari pasien bahkan dapat dilihat sebagai metode untuk meningkatkan penyaringan terapeutik jika dibandingkan dengan model hewan, mengingat kemampuannya untuk menyajikan mekanisme molekuler, seluler, dan imunologi yang lebih relevan. 23 Aplikasi terkini dari penyaringan spesifik pasien dan penyakit tersebut dalam DOC telah difokuskan pada kemanjuran kemoterapi. Dalam karya penting mereka yang terkait dengan DOC, Tanaka dkk. mengeksplorasi konsep ini melalui penyelidikan sensitivitas kemoterapi spesifik pasien terhadap organoid karsinoma sel skuamosa kepala dan leher (HNSCC) yang berasal dari pasien. 99 Organoid HNSCC yang diformulasikan ditemukan memiliki fitur histologis dan sensitivitas obat yang serupa (cisplatin dan docetaxel) dengan tumor genesisnya, sangat kontras dengan kultur sel monolayer. Kepekaan terhadap kemoterapi juga ditemukan berbeda antara kelompok organoid HNSCC, yang selanjutnya merangkum karakteristik tumor asli menuju pengembangan pengobatan presisi untuk HNSCC.

Heterogenitas pasien dari efikasi kemoterapi telah dieksplorasi lebih lanjut oleh Driehuis et al. dengan menggunakan organoid mukosa oral manusia tipe liar dalam studi leukemia limfoblastik akut pediatrik. 100 Organoid mukosa yang dikembangkan secara efektif merangkum komposisi berlapis-lapis, fungsi, dan karakteristik histologis epitel mukosa asli dan menunjukkan sensitivitas terhadap dosis kemoterapi metotreksat yang relevan secara klinis dan obat kemoterapi pelindung leucovorin. Pekerjaan ini menemukan bahwa efektivitas leucovorin dalam mengurangi toksisitas mukosa berbeda secara signifikan antara organoid yang berasal dari donor yang berbeda, menyiratkan efek khusus donor dan mengonfirmasi pengamatan ketergantungan dosis yang diamati dengan pengobatan leucovorin secara klinis. Dalam kelanjutan dari pekerjaan ini, Driehuis et al. mengembangkan 31 model organoid yang berasal dari karsinoma sel skuamosa kepala dan leher (HNSCC) untuk merangkum keragaman dan spesifisitas genetik dan molekuler yang diamati sebelumnya. 88 varian organoid HNSCC ditemukan memiliki respons yang berbeda terhadap kemoterapi konvensional (termasuk cisplatin, carboplatin, cetuximab), radioterapi, dan obat-obatan target yang biasanya tidak digunakan dalam pengobatan pasien dengan HNSCC secara in vitro. Pengamatan ini dapat menginspirasi pendekatan yang dipersonalisasi untuk pengelolaan HNSCC dan memperluas repertoar obat-obatan HNSCC.

4.3 Terapi berbasis sel yang ditingkatkan
Mengingat sifat hierarkis dan heterogen jaringan DOC, terapi sel berbasis organoid telah disarankan. Dibandingkan dengan terapi sel berbasis sferoid yang biasanya digunakan untuk pengiriman agregat sel induk guna meningkatkan regenerasi jaringan, terapi sel berbasis organoid menggunakan tingkat mimikri dan organisasi jaringan yang lebih tinggi, yang memiliki potensi besar dalam regenerasi jaringan dan organ utuh secara langsung pada DOC. 101 , 102

Salah satu contohnya adalah regenerasi gigi de novo yang memanfaatkan organoid benih gigi. Gigi adalah jaringan hierarkis yang kompleks, yang terdiri dari daerah diskrit keras (enamel, sementum, dentin) dan lunak (pulpa). Organoid benih gigi terbentuk melalui kontrol ketat interaksi sel epitel dan mesenkim gigi yang dicapai melalui media diferensiasi dan desain perancah. Tsuji et al. adalah orang pertama yang berhasil mengembangkan organ ektodermal dari metode kultur benih organoid. 103 Organoid benih gigi yang dikembangkan menghasilkan pembentukan gigi yang benar secara struktural baik dalam kultur organ in vitro dan, setelah implantasi organoid gigi in vivo, yang menunjukkan pembentukan ligamen periodontal inang, penetrasi pembuluh darah, dan serabut saraf. Konsep yang menarik untuk regenerasi seluruh struktur gigi yang direkayasa secara biologis ini telah diperluas dalam model anjing 104 dan babi 105 . Strategi organoid benih gigi lainnya telah memperluas konsep ini dengan menggunakan sel punca pulpa gigi (dibandingkan sel mesenkimal autolog) untuk mengembangkan gigi rekayasa hayati yang sukses.106 Pengembangan terkini di area ini difokuskan pada desain perancah untuk memandu pengembangan pembentukan gigi dari organoid benih gigi, karena gigi rekayasa hayati belum bisa menyamai bentuk gigi asli .

Dalam konteks jaringan lunak mulut, penerapan organoid kelenjar ludah telah dieksplorasi untuk potensi penggunaannya dalam terapi regeneratif. Seperti halnya gigi asli, kelenjar ludah sangat sulit untuk direkayasa secara biologis mengingat fungsi sekresinya, interaksi epitel-mesenkim, dan respons terhadap sinyal endogen dan eksogen, sehingga lebih cocok untuk pendekatan regeneratif organoid. 87 Memang, organoid kelenjar ludah yang dicangkok secara ortotopik menunjukkan ciri-ciri sistem saraf, yang menghasilkan sekresi ludah penuh, yang menunjukkan bahwa organoid tersebut memiliki potensi besar untuk digunakan dalam perbaikan dan regenerasi kelenjar ludah. ​​91

Selain peningkatan pemodelan dan penyaringan terapi spesifik penyakit dan pasien, organoid yang berasal dari pasien dan donor memiliki potensi signifikan dalam strategi regenerasi jaringan langsung. 101 , 102 Organoid yang diisolasi dari pasien mendapat manfaat dari penghindaran komplikasi yang terkait dengan penolakan imun dan mungkin menjadi kandidat yang lebih cocok untuk memajukan pekerjaan regenerasi jaringan mulut multiseluler secara in vivo.

4.4 Organoid DOC: ringkasan
Sementara organoid oral memang menyajikan cara pemodelan jaringan oral yang diperluas jika dibandingkan dengan kultur monolayer dan spheroid, masih ada kasus terapan yang terbatas dari penggunaannya dalam penyaringan terapeutik dan strategi regenerasi langsung dalam DOC. Kasus penggunaan organoid yang terbatas dalam aplikasi ini mungkin didorong oleh kompleksitasnya yang bertambah, mengingat kebutuhan untuk mengoptimalkan kondisi lingkungan mikro untuk beberapa jenis sel dan jaringan secara bersamaan. Meskipun, ini adalah tantangan yang telah diatasi oleh organ lain dalam fisiologi manusia, dan karenanya diantisipasi bahwa mereka harus dapat diatasi dengan studi masa depan. Contoh spesifik dari tantangan yang memerlukan perhatian termasuk pertimbangan pembentukan organoid (baik yang direkayasa atau berasal dari pasien), yang sering kali memerlukan desain media dan kultur yang berulang (dijelaskan panjang lebar di tempat lain 107 ), dan dapat menambah kompleksitas eksperimental jika dibandingkan dengan kultur monolayer dan spheroid. Misalnya, kultur organoid SG bergantung pada integrasi dan kontrol ketat faktor pertumbuhan (seperti BMP-4, FGF-7, FGF-10, dan FGF-2) untuk memodulasi pertumbuhan dan perkembangannya dalam kultur. Kompleksitas tambahan muncul dalam penilaian organoid oral yang dikembangkan, di mana pencangkokan mereka ke dalam jaringan oral in vivo sering digunakan dalam evaluasi titik akhir. Yang terakhir meningkatkan sifat intensif sumber daya dari pemodelan organoid oral secara terpisah. Ada juga keterbatasan yang tersisa dalam karakter fisiologisnya, yaitu dikaitkan dengan kebutuhan akan rangsangan mekanis yang relevan secara fisiologis. Sebagian besar metode terkini, yang diterapkan untuk memodifikasi organoid oral dan maksilofasial, bergantung pada simulasi kekakuan dan arsitektur ECM melalui bioprinting 3D dan biomaterial baru sebagai perancah. Namun, regulasi spasiotemporal yang tepat dan kontrol organisasi diri keduanya perlu dicapai dengan memanfaatkan perangkat mikrofluida dan perancah yang direkayasa lebih lanjut.

5 MODELING DOC JARINGAN PADA CHIP
Metode on-chip mewakili kelas sistem mikrofisiologis terbaru dalam DOC yang mencakup fitur-fitur yang menguntungkan dari kultur sferoid dan organoid sambil memanfaatkan fluida dinamis dan ruang kultur diskret. Penambahan aliran dinamis dan isyarat mekanis terkait untuk jaringan in vitro yang dikultur pada chip telah terbukti meningkatkan tingkat fitur emulasi jaringan yang lebih tinggi, termasuk representasi fungsi spesifik organ dan relung penghalang yang lebih baik. 23 Relung jaringan termasuk kulit dan esofagus yang memiliki epitel berlapis yang mirip dengan epitel oral telah ditemukan aplikasinya dalam model chip organ. 108 Dalam konteks jaringan DOC, metode on-chip juga memberikan potensi untuk menggunakan antarmuka fluida yang unik (seperti lingkungan yang kaya oksigen) untuk mensimulasikan interaksi kompleks mikroorganisme dalam rongga mulut. Tinjauan terkini telah secara komprehensif menggambarkan aplikasi model on-chip dalam jaringan lunak oral, 28 gigi, 109 dan DOC secara umum. 29 , 110 Di sini, kami secara khusus menyoroti utilitas sistem on-chip saat ini dalam DOC untuk meningkatkan emulasi fisiologis pemodelan penyakit dan penyaringan terapeutik, serta untuk memungkinkan desain terapi sel regeneratif.

5.1 Rangsangan lingkungan dan pemodelan penyakit jaringan DOC
Dengan mengembangkan konsep kultur sferoid dan organoid, sistem on-chip dapat digunakan untuk mensimulasikan penyakit dan jaringan DOC secara in vitro dengan lebih baik, yang dimungkinkan oleh pengenalan mikrofluida dan desain multisaluran. Penambahan fluida dan beberapa saluran telah memungkinkan interaksi dan tantangan jaringan/mikrobiologi oral yang lebih relevan secara fisiologis melalui pengenalan aliran dinamis, antarmuka beroksigen, dan desain sensor terintegrasi. Baik aliran dinamis maupun antarmuka beroksigen dapat menyediakan lingkungan yang lebih relevan secara fisiologis untuk mempelajari perilaku mikroba seperti pembentukan biofilm, yang tidak ditiru dengan tepat atau tidak mungkin dipertahankan dalam kultur statis jangka panjang. Selain itu, penggunaan sistem on-chip berpotensi untuk mengintegrasikan desain sensor yang, dalam kasus interaksi jaringan inang/mikrobiologi, telah digunakan untuk menilai integritas dan fungsi penghalang jaringan epitel secara in vitro. 111 , 112

Dalam DOC, sebagai perluasan organoid mukosa oral, model on-chip mukosa oral telah dikembangkan untuk mengeksplorasi dampak mikrobiologis pada jaringan lunak oral menuju pemahaman yang lebih baik tentang mukositis dan periodontitis. Misalnya, Rahimi et al. mengembangkan sistem on-chip mukosa gingiva untuk menyelidiki dampak bakteri oral Streptococcus mutans (salah satu agen etiologi utama karies gigi). 113 Sistem awal ini terdiri dari hidrogel kolagen bermuatan fibroblas gingiva dengan lapisan keratinosit eksternal yang dirakit dalam chip mikrofluida tiga saluran. Model ini menghasilkan saluran samping apikal yang mampu menjaga stabilitas selama kultur jangka panjang di bawah aliran yang relevan secara fisiologis dan paparan tantangan S. mutans . Sebagai perluasan dari konsep ini, Jin et al. mengeksplorasi pengembangan model on-chip penghalang epitel gingiva yang sangat vaskularisasi. 114 Model ini terbukti merangkum fungsi barier dan kaskade respons tingkat organ yang kompleks pada jaringan gingiva manusia setelah terpapar lipopolisakarida bakteri, yang berfungsi sebagai platform potensial untuk menyelidiki perkembangan penyakit periodontal. Baru-baru ini, Sriram dkk. mengembangkan sistem mikrofluida alternatif yang mengintegrasikan antarmuka udara-cair ke dalam pengembangan model gingiva pada chip. 115 , 116 Kelompok Sriram telah menunjukkan bahwa platform pada chip ini dapat memungkinkan matriks mukosa yang representatif, morfogenesis epitel yang lebih baik, dan fitur barier yang stabil selama kultur jangka panjang. Yang terakhir telah digunakan dalam penyelidikan ulkus mukosa mulut dan sistem kultur bersama dengan mikroba mulut yang relevan.

Melalui penambahan aliran, model pada chip juga memungkinkan modulasi rangsangan fisik yang terkait dengan fitur mekanis dan fungsional jaringan oral. Le et al. mengembangkan platform pada chip mukosa oral untuk menyelidiki dampak rangsangan mekanis pada fungsi penghalang epitel, menemukan bahwa kekakuan jaringan sub-epitel secara signifikan memodulasi fungsi penghalang epitel. 117 Modulasi isyarat fisik pada chip (seperti kekakuan dan aliran geser) juga dapat berguna dalam pemodelan tingkat keparahan OSCC, di mana keadaan penyakit telah diamati menghasilkan sifat mekanis yang berbeda secara in vivo. 118 Model OSCC-on-chip memiliki potensi untuk memodulasi faktor-faktor ini dan faktor lainnya, sambil mengintegrasikan berbagai jenis sel/jaringan untuk membantu memperluas pemahaman kita tentang kaskade metastasis. Misalnya, menggunakan pendekatan mikrofluida, Lugo-Cintron et al. menemukan bahwa pembuluh limfatik yang terpapar fibroblas yang berasal dari tumor dari pasien menginduksi pertunasan, mengubah permeabilitas pembuluh, dan meningkatkan ekspresi gen pro-limfangiogenik dalam cara yang spesifik pada pasien, menawarkan wawasan ke dalam jalur yang tidak teratur yang mengarah pada limfangiogenesis. 119 Platform semacam itu dapat menyediakan platform penting untuk mempelajari kanker langka dan komorbiditas spesifik pasien.

5.2 Peningkatan skrining terapi dan toksisitas sistemik
Mengingat tingkat emulasi jaringan dan organ yang lebih tinggi, banyak aplikasi sistem kultur pada chip telah menyelidiki penggunaannya sebagai platform penyaringan terapeutik. 120 Sebagai perluasan dari relevansi klinis yang lebih tinggi untuk organoid yang berasal dari pasien, integrasi model tersebut pada chip memungkinkan pemodelan kinetika perfusi obat yang lebih relevan, efek batas, dan memberikan potensi untuk kultur jangka panjang. 121

5.2.1 Modulasi mikroba
Karena disbiosis mikrobioma oral sangat berbahaya dan spesifik pada pasien, model on-chip telah digunakan secara luas untuk mempelajari perilakunya. 122 Metode on-chip secara unik memungkinkan studi dinamis langsung dari biofilm oral, di mana dalam karya Nance et al., mereka menggunakan mikrofluida untuk mengembangkan salah satu sistem on-chip biofilm oral pertama. 123 Dengan menggunakan isolat dari seluruh air liur manusia, model ini secara khusus merangkum komposisi dan arsitektur biofilm plak gigi asli secara in vitro, yang memungkinkan penyaringan multi-spesies dari obat kumur berbasis amonium kuarterner. Strategi biofilm gigi serupa telah dikembangkan menggunakan platform on-chip yang bertujuan untuk meningkatkan hasil, 124 rezim aliran yang dimodifikasi, 125 visualisasi biofilm, 126 dan resolusi interaksi imun antar-spesies dan inang 127 menuju pengembangan dan penyaringan yang lebih baik dari produk dan terapi modulasi plak dan perawatan mulut.

5.2.2 Skrining radiasi dan kemoterapi
Kemampuan platform kultur pada chip untuk menyediakan ceruk jaringan tertentu (seperti yang dijelaskan sebelumnya) membuatnya berguna dalam penyaringan terapi kanker berbasis radiasi dan obat pada DOC. Baik radiosensitivitas tipe sel DOC kanker dan perifer telah dieksplorasi dalam model pada chip. Kennedy et al. mengembangkan platform tumor-pada-chip yang unik untuk mengeksplorasi efek spesifik pengobatan radiasi pada tumor pasien yang dikultur secara eks vivo. 128 Dalam model yang diperluas, Song et al. memanfaatkan model pada chip kelenjar ludah untuk menyelidiki disfungsi kelenjar ludah setelah terapi radiasi. 129 Dalam karya ini, berbeda dengan kultur organoid saja, desain chip yang direkayasa memungkinkan kultur jangka panjang, studi pengkondisian autokrin/parakrin, dan pencitraan in situ, yang memungkinkan penyaringan senyawa radioprotektif pada fungsi kelenjar ludah. ​​Baru-baru ini, model mukositis oral dikembangkan untuk mengevaluasi efek perifer dari radiasi gabungan dan pengobatan kemoterapi pada fungsi penghalang jaringan mukosa oral. 130 Model ini secara efektif merangkum kerusakan epitel, ulserasi, dan sitotoksisitas yang terjadi pada jaringan mukosa setelah pengobatan kanker. Hal ini memungkinkan proses tersebut dipantau secara in situ dan sejak itu telah digunakan untuk menyelidiki dampak faktor pertumbuhan keratinosit manusia rekombinan dalam mengurangi mukositis yang disebabkan oleh pengobatan. 131

5.2.3 Intervensi Biomaterial
Metode on-chip memungkinkan cara yang lebih luas untuk memodelkan interaksi biomaterial. Sementara interaksi permukaan langsung dapat dilihat sebagai model yang efektif dalam sistem kultur statis, efek material yang dapat terdegradasi atau larut paling baik direpresentasikan dalam kultur berkelanjutan.

Dalam DOC, faset yang disebutkan sebelumnya khususnya berguna dalam pemodelan bahan restorasi gigi, yang telah ditunjukkan memiliki beberapa elemen yang dapat larut secara sitotoksik dan genotoksis. 132 , 133 Bahan restorasi gigi tersebut telah dieksplorasi pada model-model gigi on-chip yang baru muncul. 109 Model-model gigi on-chip seminal baru-baru ini dikembangkan oleh Hadjichristou et al. dan Bertassoni et al. secara paralel. 58 , 134 – 136 Kedua model tersebut mencakup analog dentin/pulpa fungsional dan telah digunakan sebagai alat penilaian sitotoksisitas tingkat lanjut untuk bahan restorasi gigi termasuk semen, perekat resin, dan etchant bonding. Sistem gigi on-chip tersebut juga dapat berperan dalam menjelaskan aspek-aspek spesifik dari kegagalan restorasi gigi. Bertassoni et al. menemukan peningkatan aktivitas gelatinolitik pada lapisan hibrida model (HL) dalam model on-chip mereka, yang menunjukkan bahwa sel pulpa gigi dapat berkontribusi pada aktivitas proteolitik di HL lebih dari protease endogen, yang dapat berkontribusi pada kegagalan restoratif in vivo. 58 Hadjichristou dkk., dalam penyelidikan mereka terhadap semen dan perekat, menjelaskan efek kombinasi bahan restoratif dengan lipopolisakarida (LPS) pada odontogenesis , angiogenesis, dan viabilitas sel.

Selain efek bahan restoratif secara langsung pada gigi, efek perifer bahan yang dapat larut pada jaringan DOC telah dieksplorasi menggunakan model pada chip. Misalnya, menggunakan model pada chip mukosa, Rahimi et al. menyelidiki efek monomer restoratif yang dapat larut (HEMA) pada jaringan mukosa. 113 Paparan terhadap HEMA ditemukan dapat menurunkan viabilitas sel mukosa dan resistansi listrik transepitel. Hu et al., dalam persiapan model pada chip gigi mereka sendiri, membandingkan efek sitotoksik perawatan diamina perak (SDF) dengan analog epitel gigi dan gingiva. 137 Studi ini menemukan SDF secara efektif menembus dentin dan menimbulkan efek sitotoksik yang ekstrem pada sel pulpa gigi di chip dentin/pulpa dan menunjukkan toksisitas yang secara histologis serupa pada ekuivalen epitel gingiva dengan yang ditemukan secara in vivo. Investigasi lain yang dilakukan oleh kelompok Sriram menemukan efek perifer negatif serupa dari obat kumur restoratif oral pada jaringan epitel gingiva pada chip. 115

Di luar penilaian restorasi gigi, strategi biomaterial on-chip yang baru telah dikembangkan untuk menyelidiki implan gigi. Dengan menggunakan model on-chip implan gigi yang baru, Dhall dkk. menyelidiki dampak arsitektur implan yang dimultipleks dengan tantangan bakteri pada integrasi sel periodontal. 138 Dengan menggunakan terapi fotobiomodulasi, lapisan epitel implan secara efektif terlindungi dari tantangan bakteri yang berulang dan menunjukkan kerusakan seluler yang minimal. Sistem yang dimultipleks seperti itu dapat memberikan model yang lebih relevan secara fisiologis untuk mempelajari interaksi host-biomaterial dalam DOC.

5.2.4 Toksisitas multiorgan dan sistemik
Salah satu fitur unik dari model on-chip adalah potensi untuk menghubungkan beberapa organ atau sistem jaringan bersama-sama. Jaringan lunak DOC, seperti mukosa mulut, merupakan penghalang utama dalam mencegah paparan oral terhadap zat yang dapat larut atau racun dari akses sirkulasi dan akumulasi dalam sistem organ perifer. Selain itu, paparan oral terhadap racun (seperti logam) diketahui dapat mengaktifkan sistem imun, yang dapat menyebabkan efek perifer termasuk peradangan kulit. Untuk mempelajari efek ini, Koning dkk. mengembangkan sistem on-chip multiorgan gingiva dan kulit yang baru untuk mengevaluasi zat yang dapat larut nikel dari bahan restorasi gigi. 139 Sistem ini menggunakan gingiva manusia yang direkonstruksi dan bilik dermal dengan sel Langerhans turunan MUTZ-3 (MUTZ-LC) terintegrasi untuk menyelidiki kejadian imun lokal yang terlibat dalam toleransi, sensitisasi, dan timbulnya alergi kontak. Sementara paparan nikel terbukti tidak memiliki efek pada jaringan gingiva, bilik dermal ditemukan memiliki peningkatan aktivasi MUTZ-LC dan sensitisasi.

5.3 DOC pada chip: ringkasan
Saat ini, sistem OoC merupakan cara paling efektif untuk meniru fungsi organ dan jaringan secara in vitro, yang dimungkinkan melalui integrasi mikrofluida, antarmuka multi-fluida, desain multi-bilik, dan pemantauan in situ. Dalam DOC, sistem OoC mulai bermunculan, dan kini ada beberapa contoh yang telah digunakan untuk memodelkan rangsangan lingkungan, status penyakit jaringan, kemanjuran terapeutik, dan toksisitas sistemik dengan lebih baik. Saat ini, platform OoC memiliki aplikasi terbatas dalam merekapitulasi jaringan keras kraniofasial dan jaringan kompleks multi-domain fungsional dalam periodonsium. Sementara platform bone on-chip saat ini sedang dalam pengembangan, 140 sistem tersebut menghadapi tantangan yang terkait dengan organogenesis tulang pada chip, yang memerlukan penerapan rangsangan mekanis kompleks (melebihi yang disediakan oleh aliran geser) dan lingkungan mikro tulang yang sesuai. Kemampuan untuk memodelkan jaringan tulang dan antarmuka jaringan keras pada chip dapat memungkinkan investigasi yang lebih baik terhadap perkembangan penyakit DOC yang kompleks, seperti periodontitis. Selain kurangnya platform jaringan keras yang tersedia, platform chip DOC saat ini kurang dimanfaatkan dalam penyelidikan terapi oral regeneratif langsung dan biomaterial. Pemodelan biologik yang disetujui FDA (misalnya rhPDGF-BB) atau biomaterial (misalnya matriks kolagen) menggunakan platform jaringan lunak yang relevan (seperti mukosa pada chip) dapat memberikan cara yang efektif untuk memvalidasi sistem in vitro dengan hasil klinis.

6 SISTEM MIKROPISIOLOGI SEBAGAI MODEL PRA-KLINIS DALAM DOC
Minat dalam kesehatan dan penyakit mulut telah meluas dalam beberapa tahun terakhir, 141 menghasilkan peningkatan upaya penelitian dan metodologi trickle-down dari area biomedis penting lainnya, termasuk sistem mikrofisiologi in vitro yang lebih canggih. Bersama-sama, sistem spheroid, organoid, dan on-chip mewakili model yang berguna untuk merekapitulasi jaringan DOC secara in vitro dengan lebih baik jika dibandingkan dengan kultur 2D konvensional. Berdasarkan emulasi yang ditingkatkan, platform OoC menghadirkan sistem in vitro titik akhir yang paling mungkin, yang mampu menggantikan atau membatasi penggunaan hewan sebagai model praklinis, yang secara signifikan dapat mengurangi beban sumber daya dan meningkatkan jalur pengembangan DOC. Namun, keterbatasan dan tantangan masih perlu diatasi, baik dalam metode DOC-OoC maupun OoC secara umum, sebelum adopsi mereka sebagai model praklinis alternatif menjadi praktik yang umum diadopsi.

Dalam DOC, saat ini ada beberapa contoh sistem OoC yang bertujuan untuk mensimulasikan sifat multifaset penyakit dan perkembangan manusia. Misalnya, beberapa studi dalam DOC telah berupaya untuk mensimulasikan fungsi kekebalan tubuh manusia pada chip, yang merupakan fitur yang sudah lazim di platform OoC lain yang menyajikan keuntungan yang signifikan atas evaluasi praklinis yang memanfaatkan vertebrata yang mengalami gangguan kekebalan. 67 , 142 Selain itu, ada beberapa contoh dalam DOC yang bertujuan untuk menjelaskan status penyakit yang berhubungan—seperti hubungan patogen oral dengan tumorigenesis kanker oral, 143 dan dampak potensial dari mikrobioma untuk melindungi (atau memperburuk) cedera yang disebabkan oleh radiasi, yang sebelumnya ditemukan dalam model usus. 144 Meskipun penyakit dan gangguan oral semakin dikaitkan dengan penyakit sistemik, saat ini ada contoh terbatas yang menghubungkan chip organ DOC secara seri dengan OoC lain untuk meniru sistem organ atau “tubuh” pada chip yang telah menemukan aplikasi dalam konfigurasi OoC lainnya. 145 , 146 Di luar DOC, sistem OoC saat ini dibatasi oleh standardisasi dan validasi in vivo. Standardisasi sekarang sedang ditangani melalui komersialisasi chip kultur mikrofluida platform (seperti yang diproduksi oleh Emulate™ dan lainnya), yang berdiri untuk terus meningkatkan baik reproduktifitas dan standardisasi temuan OoC. Selain itu, untuk penggantian lengkap model hewan praklinis, sistem OoC tidak hanya perlu menampilkan homologi jaringan yang ditingkatkan dengan ceruk target in vivo, tetapi juga memiliki potensi untuk lebih baik memprediksi kinerja klinis manusia in vitro jika dibandingkan dengan model hewan. Karena badan pengatur telah mulai mendorong penggunaan platform OoC dalam data praklinis, aspek ini akan menerima perhatian yang lebih besar di tahun-tahun mendatang.

Sementara eliminasi lengkap hewan, sebagai model praklinis, mungkin belum memungkinkan saat ini, sistem mikrofisiologis yang canggih dapat digunakan dalam jalur pengembangan alternatif untuk mengurangi pemodelan hewan dan berpotensi meningkatkan penerapan klinis terapi DOC (Gambar 2 ). Model praklinis konvensional dalam DOC telah menggunakan hewan secara ekstensif, hadir dalam hampir 40% publikasi terbaru dalam literatur DOC yang relevan. 147 Pilihan model dalam DOC telah berkembang selama 50 tahun terakhir, 147 , 148 dengan distribusi spesies hewan praklinis sekarang lebih sering terdiri dari mamalia yang lebih kecil (seperti tikus dan mencit), yang telah berfungsi untuk mengatasi pertimbangan etika, biaya, dan pasokan. Namun, penggunaan hewan kecil tersebut terhambat oleh perbedaan anatomi dan penyembuhan mereka, jika dibandingkan dengan mamalia yang lebih besar. Karena alasan ini, metode dalam penelitian DOC selalu mempertimbangkan filogeni di seluruh studi in vivo, di mana validasi terapeutik dilakukan secara berurutan pada mamalia yang lebih besar menuju peningkatan relevansi fisiologis. Selain kompleksitas penelitian multi-hewan, model hewan in vivo sering kali tidak mampu menggambarkan keadaan penyakit manusia seperti peradangan, 149 yang berpotensi menyebabkan hasil positif atau negatif palsu bagi kandidat terapi untuk memasuki uji klinis.
GAMBAR 2
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Pemodelan praklinis tradisional versus alternatif dalam pengembangan terapi DOC. Gambar ini dibuat dengan bantuan www.Biorender.com .
Dalam alur pengembangan alternatif yang diusulkan, evaluasi in vitro monolayer tradisional disarankan untuk diikuti oleh model mikrofisiologis yang semakin emulatif sebelum validasi terapi akhir in vivo. Ini mungkin berfungsi untuk mewakili analog in vitro dari pendekatan filogenetik saat ini yang digunakan dalam model in vivo praklinis. Menggunakan evaluasi antara yang semakin relevan secara fisiologis in vitro, sebelum pemodelan hewan, dapat meningkatkan kemanjuran dan efisiensi skrining, menghasilkan wawasan yang lebih baik tentang mekanisme terapeutik, dan mengurangi jumlah total penelitian hewan. Dalam skema ini, model in vivo dapat digunakan untuk menjawab pertanyaan spesifik yang terkait dengan fisiologi mamalia yang tidak dapat dipenuhi oleh metode in vitro saat ini, dengan ukuran sampel dan kompleksitas eksperimen yang berkurang secara signifikan.

Biaya memerlukan pertimbangan signifikan dalam fase pemodelan praklinis untuk pengembangan terapi baru pada DOC, yang dapat mencapai >40% dari total biaya translasi. 150 – 152 Dalam konteks penelitian yang didanai publik, penggantian satu model hewan besar dari pengembangan praklinis saja dapat mengurangi pengeluaran sumber daya secara signifikan. Pada tahun 2024, National Institute of Health—National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH-NIDCR) mendukung total 146 studi DOC praklinis tahun pertama dengan nilai rata-rata $277.000 USD. 153 Dengan menggunakan estimasi konservatif biaya pemeliharaan hewan saja, satu studi anjing praklinis kecil, yang sering digunakan untuk memodelkan peri-implantitis, dapat menghabiskan biaya lebih dari $120.000 USD, yang berpotensi mewakili lebih dari 43% dari total pendanaan studi. 154 Penggunaan model in vitro canggih alternatif dan lebih relevan, seperti DOC-OoC, dapat mengurangi biaya evaluasi praklinis, sekaligus memungkinkan informasi berharga tambahan untuk diperoleh. Dalam penyaringan beberapa kandidat terapi, diperkirakan bahwa model OoC dapat menghasilkan pengurangan biaya lebih dari sepuluh kali lipat dan pengurangan waktu studi empat kali lipat dibandingkan dengan penyaringan pada model hewan besar yang setara. 155 Selain itu, pengurangan biaya dan waktu studi praklinis akan memberdayakan peneliti di negara berkembang dan di wilayah dengan kebijakan pengujian hewan yang ketat atau terbatas untuk menerjemahkan penemuan di laboratorium ke ranah klinis.

7 KESIMPULAN
Penyakit dan gangguan jaringan gigi, mulut, dan kraniofasial (DOC) merupakan beban global yang signifikan dan telah terbukti memiliki prevalensi dan insidensi terstandar usia terbesar di seluruh dunia. Sementara penerapan terapi baru telah disarankan untuk mengatasi beban global ini, sejumlah kecil terapi regeneratif tersebut tersedia secara klinis untuk berkontribusi pada peningkatan hasil terapi, dengan hanya segelintir terapi yang diterjemahkan ke dalam klinik selama 10 tahun terakhir. Kurangnya terapi baru dalam regenerasi jaringan DOC dapat dikaitkan dengan jalur penerjemahan yang sangat intensif sumber daya dari model praklinis ke uji klinis, yang terutama didorong oleh pengujian ekstensif pada model hewan untuk mengatasi rintangan regulasi. Baru-baru ini, para pemangku kepentingan dan badan regulasi (termasuk Badan Pengawas Obat dan Makanan AS) telah mulai mendorong penggunaan alternatif untuk model hewan, yang dimotivasi oleh perspektif kemanusiaan dan pertanyaan tentang relevansinya dalam model praklinis.

Hal ini dapat memberikan peluang untuk mengurangi atau menghilangkan pengujian hewan, yang pada akhirnya mengurangi pengeluaran sumber daya dan menyediakan jalur regulasi yang lebih efisien untuk persetujuan terapi DOC baru. Karena kompleks DOC mewakili kelompok relung jaringan yang saling berhubungan, cacat dan penyakit tidak dirangkum secara efektif dalam model kultur in vitro 2D atau 3D tradisional. Namun, munculnya model in vitro yang lebih canggih (atau yang disebut sistem mikrofisiologis yang mencakup sistem sferoid, organoid, dan organ pada chip) telah memungkinkan pemodelan penyakit dan regenerasi DOC yang lebih efektif, melalui emulasi fisiologi DOC yang ditingkatkan. Sementara model tersebut tidak dapat sepenuhnya menggantikan penggunaan hewan dalam model praklinis, jalur translasi alternatif menggunakan pendekatan pseudo-filogenetik dapat meningkatkan efisiensi translasi melalui penyaringan kandidat utama yang ditingkatkan dan dengan memberikan pemahaman mekanistik tentang terapi pada jaringan yang berasal dari pasien. Karena platform OoC dalam DOC secara progresif meningkatkan emulasi fungsi kekebalan dan multi-organ manusia, platform tersebut dapat berfungsi sebagai alternatif hewan masa depan untuk aplikasi menuju validasi terapeutik yang efisien dan translasi ke arena klinis. Bersama-sama, penggunaan pendekatan ‘filogenetik’ in vitro dapat mengurangi beban sumber daya dan berpotensi meningkatkan keberhasilan kemanjuran kandidat utama dalam uji klinis.